高產胞外多糖沙棘根瘤內生細菌的篩選、鑒定及其發酵條件優化

(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070)

多糖是自然界中含量最豐富的天然大分子化合物,廣泛存在于動、植物組織以及藻類和微生物發酵液中[1],根據其來源不同可分為動物多糖、植物多糖、真菌多糖、藻類多糖和細菌多糖[2]。相較于其他種類多糖而言,細菌多糖具有生產周期短,不受季節、地域、病蟲害條件限制等優點。細菌多糖根據其存在形式,可分為三種:以脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)O抗原的形式吸附在細胞膜表面,以莢膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)的形式粘附在細胞周圍,或是以胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)的形式分泌至周圍環境中[3]。相比胞內合成多糖的方式,分泌到細胞外的多糖在獲取時,更易與菌體分離,避免破壞細胞的生理結構及其活性,使多糖的獲取更具延續性,并能通過深層發酵實現工業化生產。目前,已大量投產的細菌多糖主要有黃原膠、結冷膠、普魯蘭多糖等[4],可作為凝固劑、乳化劑等被廣泛應用于食品、化工、制藥等多種領域,具有較強的市場競爭力和廣闊的發展前景[5]。

據統計[6],現已發現49屬76種微生物產胞外多糖,其中產胞外多糖的細菌主要有根瘤菌(Rhizobium)、芽孢桿菌(Bacillus)、鏈球菌(Streptococcus)、乳桿菌(Lactobacillus)等,但關于植物內生菌產胞外多糖的研究甚少[7]。植物內生菌(Endophyte)作為一種新型的微生物資源,在利用宿主植物提供的營養物質與生存空間的同時,通過分泌生物活性物質,對寄主植物產生多種生物學作用,具有重大研究意義和應用價值[8]。沙棘是胡頹子科沙棘屬的落葉灌木或亞喬木,根系發達,被弗蘭克氏菌侵染根部后共生形成根瘤。除弗蘭克氏菌外,沙棘根瘤中還含有其他種類內生細菌[9],能夠向胞外分泌次級代謝產物。

本文對實驗室分離到的沙棘根瘤中的6株能夠產生胞外多糖的內生細菌進行研究,篩選出高產胞外多糖的菌株,對其進行鑒定,并對高產胞外多糖菌株的發酵條件進行優化,確定該菌株的最佳產糖條件,以期為產胞外多糖的沙棘根瘤內生細菌的工業化生產提供參考,并為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6株分離自沙棘根瘤中的內生細菌 由本實驗室篩選并保藏;PCR引物 為通用引物,由北京諾禾致源生物信息科技有限公司合成;透析袋(MD44,截留分子量7000) 上海泰坦科技股份有限公司;葡萄糖、蔗糖、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、蛋白胨等試劑 均為國產分析純。

H1850R型臺式高速冷凍離心機 長沙高新技術產業開發區湘儀離心機儀器有限公司;V-5000型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;PHS-3C型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司;12ND型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-3000型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;HZQ-F160A型恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;MyCycleTM Thermal Cycle PCR儀 德國Biometra公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 牛肉膏蛋白胨培養基:牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂18 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

QMOD培養基:葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、酵母浸膏0.5 g/L、K2HPO40.3 g/L、NaH2PO40.2 g/L、KCl 0.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCO30.1 g/L、檸檬酸鐵1 mL/L、卵磷脂1 mL/L、玉米素100 μL/L、JA微量元素原液1 mL/L、瓊脂18 g/L,pH6.8～7.0,115 ℃滅菌20 min。

TB培養基:胰蛋白胨12 g/L、酵母提取物24 g/L、甘油4 mL/L、K2HPO412.54 g/L、KH2PO42.31 g/L、瓊脂18 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養基:蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養基:蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母提取物5 g/L,瓊脂18 g/L,pH7.0～7.2,121 ℃滅菌20 min。

基礎培養基[10]:葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂18 g/L,pH7.0～7.2,115 ℃滅菌20 min。

種子培養基:LB液體培養基。

基礎發酵培養基[10]:液體基礎培養基。

1.2.2 菌株的活化 利用接種環挑取斜面保存的6株產糖內生細菌,分別接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行活化,在30 ℃、220 r/min條件下振蕩培養12 h[11]。

1.2.3 菌株胞外多糖的提取 參考王爽[12]胞外多糖制備與測定的方法,略作改動。將已活化的菌株接種至LB種子培養基,180 r/min搖瓶培養24 h后,以10%的接種量轉入基礎發酵培養基中,180 r/min 30 ℃條件下發酵培養48 h后,將菌株發酵液4000 r/min離心15 min,取上清液10 mL,加入4倍體積95%乙醇,4 ℃下醇沉過夜,離心收集沉淀,將沉淀加適量水復溶,得到菌株胞外多糖水溶液,備用。

1.2.4 菌株胞外多糖產量的測定 利用苯酚-硫酸法[13]測定菌株胞外多糖水溶液中總糖的產量,利用DNS法[14]測定菌株胞外多糖水溶液中還原糖的產量,以空白培養基為對照,分別制作葡萄糖標準曲線,重復三次,將結果代入標準曲線方程,計算菌株胞外多糖的產量。

1.2.5 菌株胞外多糖產量的計算 菌株胞外多糖的產量(mg/mL)=菌株胞外多糖中總糖的產量(mg/mL)-菌株胞外多糖中還原糖的產量(mg/mL)。

1.2.6 高產胞外多糖菌株的篩選 參考1.2.3～1.2.5中的方法,將6株產胞外多糖內生細菌接入牛肉膏蛋白胨液體培養基中進行發酵,根據6株內生細菌的EPS產量篩選高產菌株。

1.2.7 菌株的鑒定

1.2.7.1 形態學鑒定 參考《常見細菌系統鑒定手冊》[15],分別依據菌株的菌落形態特征和顯微形態特征進行鑒定。

1.2.7.2 生理生化鑒定 對菌株進行淀粉水解、脂酶、明膠液化等生理生化指標檢測,參考《常見細菌系統鑒定手冊》[15]進行生理生化鑒定。

1.2.7.3 16S rRNA序列分析及系統發育樹的構建 菌株的DNA提取采用微波法[16],將振蕩培養好的菌懸液于10000 r/min離心2 min,用PBS洗滌菌體2～3次后,再次于10000 r/min離心2 min,棄上清。加入500 μL TE緩沖液進行吹打后,吸取100 μL于200 μL PCR管中10000 r/min離心2 min,棄上清。再次加入100 μL TE緩沖液進行吹打。將PCR管放入微波爐中加熱40～150 s,于5000 r/min離心1 min后收集上清,即為菌株的DNA。以目的菌株DNA為模板,選取通用引物:27F(5′-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTAC CTTGTTACGACTT-3′)進行16S rRNA的PCR擴增。

PCR反應總體系[17]為25 μL:上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板DNA(約50.0 mg/mL)4 μL,DNA聚合酶(5 U/μL)10 μL,2x Es Taq MasterMix(Dye)15 μL,加ddH2O至25 μL。PCR擴增反應條件為95 ℃預變性5 min,95 ℃變性1 min,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30個循環,最后72 ℃延伸10 min。

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行雙向測序。將測序結果提交至NCBI中GenBank數據庫,使用BLAST程序查找與目的菌株有最大同源性的核苷酸序列并下載,使用MEGA 7.0生物學軟件對序列進行分析比對,以鄰接法構建系統發育樹。結合形態學觀察及生理生化試驗結果,最終確定高產胞外多糖菌株的種屬關系。

1.2.8 最優發酵培養基的篩選 參考1.2.3～1.2.5中的方法,將高產菌株分別接種至TB液體培養基、LB液體培養基、QMOD液體培養基、牛肉膏蛋白胨液體培養基及基礎發酵培養基中,在培養溫度30 ℃、初始pH7.0、接種量10%、裝瓶量100 mL/250 mL和搖床轉速180 r/min條件下,培養48 h。分別測定不同發酵液中EPS的產量,根據高產菌株在不同發酵培養基中EPS的產量,篩選出高產菌株的最適發酵培養基,作為后續實驗的基礎發酵培養基。

1.2.9 菌株的生長曲線及產糖曲線的測定 將高產菌株接種至最優基礎發酵培養基中進行發酵。每隔2 h取一次發酵液,在600 nm處測其吸光值。在相同發酵條件下,以不接菌的基礎發酵培養基作為空白對照,重復三次,繪制菌株的生長曲線。

參照1.2.3～1.2.5中的方法,每隔2 h取一次發酵液,測定高產菌株在不同培養時間下發酵液中EPS的產量,繪制菌株的產糖曲線。根據菌株產糖曲線,將EPS產量達到最大值所對應的培養時間確定為最適培養時間。

1.2.10 發酵條件的優化 將高產菌株接種至最優基礎發酵培養基中,采用單因素法,依次探究發酵溫度、初始pH、接種量、裝瓶量以及搖床轉速對高產菌株EPS產量的影響。各因素具體實驗設置如下。

發酵溫度:設置發酵溫度分別為28、30、32、34和36 ℃,根據菌株EPS的產量確定最適發酵溫度。

初始pH:設置初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0,根據菌株EPS的產量確定最適初始pH。

接種量:設置接種量分別為2%、4%、6%、8%和10%,根據菌株EPS的產量確定最適接種量。

裝瓶量:設置裝瓶量分別為40、50、60、70、80、90和100 mL/250 mL,根據菌株EPS的產量確定最適裝瓶量。

搖床轉速:設置搖床轉速分別為120、140、160、180、200和220 r/min,根據菌株EPS的產量確定最適搖床轉速。

1.2.11 發酵培養基組分的優化 采用單因素實驗法,以基礎發酵培養基為配方,依次探究不同碳源、氮源、無機鹽的種類及其添加量對高產菌株EPS產量的影響。各因素具體實驗設置如下。

碳源種類:分別用20 g/L乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、甘露醇和可溶性淀粉替換基礎發酵培養基中的葡萄糖,在基礎發酵條件下測定菌株EPS產量,確定最適碳源。

碳源添加量:以確定的最適碳源為發酵培養基中的碳源,設置其添加量分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55和60 g/L,在基礎發酵條件下測定菌株EPS產量,確定最適碳源添加量。

氮源種類:分別用10 g/L酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、NaNO3、KNO3、NH4Cl、NH4NO3和尿素替換基礎發酵培養基中的胰蛋白胨,在基礎發酵條件下測定菌株EPS產量,確定最適氮源。

氮源添加量:以確定的最適氮源為發酵培養基中的氮源,設置其添加量分別為2、4、6、8、10和12 g/L,在基礎發酵條件下測定菌株EPS產量,確定最適氮源添加量。

無機鹽種類:分別用10 g/L KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O替換基礎發酵培養基中的NaCl,在基礎發酵條件下測定菌株EPS產量,確定最適無機鹽。

無機鹽添加量:以確定的最適無機鹽為發酵培養基中的無機鹽,設置其添加量分別為2、4、6、8和10 g/L,在基礎發酵條件下測定菌株EPS產量,確定最適無機鹽添加量。

1.2.12 正交實驗設計 結合單因素實驗結果,在最佳發酵條件下,將優化后的碳源、氮源和無機鹽設置為三個因素,并以其最適添加量為參考各設置3個水平,設計L9(34)的正交實驗,設計如表1所示。

表1 L9(34)正交實驗因素水平Table 1 The factors and levels of L9(34)orthogonal test

1.3 數據處理

所有實驗重復三次,利用Origin 7.5和SPSS 12.0對實驗數據進行統計并分析。實驗數據以平均值±標準差的形式進行表示,組間差異用Duncan檢驗。

2 結果與分析

2.1 高產胞外多糖菌株的篩選

2.1.1 葡萄糖標準曲線的測定 基于苯酚-硫酸法測定的葡萄糖標準曲線如圖1A所示,標準曲線的R2為0.99863,可用于計算菌株胞外多糖中總糖的產量。基于DNS法測定的葡萄糖標準曲線如圖1B所示,標準曲線的R2為0.99124,可用于計算菌株胞外多糖中還原糖的產量。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose concentration注:A:苯酚-硫酸法;B:DNS法。

2.1.2 高產菌株的篩選 將6株產胞外多糖的內生細菌進行液體發酵后,去除發酵液中菌體,分離、提取并測定EPS產量,結果如表2所示,菌株TT207與菌株TT301的EPS產量高于其余4株菌,因此選擇TT207與TT301進行下一步實驗。

表2 高產胞外多糖菌株的篩選結果Table 2 Screening results of the strain with

注:同列數據不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);表4,圖6,圖7同。

將菌株TT207與TT301接種至不同的培養基上,生長情況如圖2所示,菌株TT301出現菌種退化的現象,活菌數量減少,該現象的出現可能是由于培養基提供的營養條件與內生菌在宿主植物體內的營養狀況存在差異,不足以維持菌株的原始生境而影響其生長。與菌株TT207相比,菌株TT301生長緩慢,不利于后續研究,因此選擇菌株TT207作為高產菌株進行后續實驗。

圖2 菌株TT207與TT301在不同培養基上的菌落形態Fig.2 Colony morphology of strain TT207 and TT301 on different culture medium注:A:菌株TT207在基礎培養基上的菌落形態;B:菌株TT301在基礎培養基上的菌落形態;C:菌株TT207在LB培養基上的菌落形態;D:菌株TT301在LB培養基上的菌落形態。

2.2 高產胞外多糖菌株的鑒定

2.2.1 菌株TT207的形態學特征 將菌株TT207接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上,于37 ℃培養48 h后,菌落形態如圖3A所示,培養基上聚集堆積出單個菌落,菌落直徑約為1 cm,中心透明,邊緣為乳白色,表面濕潤光滑,略有突起,邊緣呈鋸齒狀,挑起時有較強黏性。待發育完全后,菌落大致分為三層,最外層呈乳白色粘液狀,中間一層為營養體呈透明突起狀,最內層向下塌陷。

菌株TT207顯微形態如圖3B所示,菌株TT207為革蘭氏陽性菌,細胞呈桿狀,并具有芽孢結構。

圖3 菌株TT207的形態學特征Fig.3 Morphological features of strain TT207注:A:菌落形態;B:100×油鏡下的顯微形態。

2.2.2 菌株TT207的生理生化特征 菌株TT207部分生理生化特征如表3所示,該菌株不利用葡萄糖發酵產氣,吲哚、V-P、甲基紅、脂酶、尿素水解反應均呈陰性反應;菌株可利用葡萄糖發酵產酸,具有運動性和固氮能力,接觸酶、淀粉水解、明膠液化、纖維素水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、硫化氫反應均呈陽性反應。

表3 菌株TT207部分生理生化試驗結果Table 3 Some physiological and biochemical test results of strain TT207

注:+:陽性反應;-:陰性反應。

2.2.3 菌株TT207的分子生物學鑒定 對菌株TT207進行16S rRNA基因序列分析,測得其基因序列長度為1445 bp。將序列提交到至NCBI中GenBank數據庫進行BLAST比對,獲取與其同源性高的菌株基因序列。利用MEGA 7.0軟件進行序列分析,通過鄰接法構建系統發育樹,結果見圖4。

圖4 菌株TT207基于16S rRNA 序列構建的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of the strain TT207 based on 16S rRNA sequences注:括號中為參與比對序列的GenBank登錄號,分支處標注為自展值,標尺所示長度為0.01核苷酸置換率。

如圖4所示,菌株TT207與Bacillussubtilis(NR027552.1)在同一分支,說明它們的同源性高、序列相似、差異小、親緣關系相近。結合形態學和生理生化特征將菌株TT207鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

2.3 最優發酵培養基的篩選

將菌株TT207分別接種于5種不同的發酵培養基中,均能產多糖,EPS產量結果見表4,但在基礎培養基中的EPS產量較高,因此選擇基礎培養基作為后續實驗中的發酵培養基進行產EPS的研究。

表4 最優培養基的篩選Table 4 Screening results of the

2.4 菌株TT207的生長曲線及胞外多糖產量曲線

經測定,發現菌株TT207在36 h左右進入穩定期,如圖5所示,此時菌株生長速度減緩,EPS大量積累,菌株TT207的EPS產量在48 h處達到最大值。因此,將48 h作為菌株TT207產胞外多糖的最佳發酵時間。

圖5 菌株TT207的生長曲線及胞外多糖產量曲線Fig.5 The growth and EPS production curve of strain TT207

2.5 發酵條件的優化

2.5.1 溫度對EPS產量的影響 溫度主要通過影響細胞膜的流動性和生物大分子的活性,進而影響微生物生命活動[22]。如圖6A所示,菌株TT207的EPS產量隨著溫度的升高而增加,當溫度達到34 ℃時,EPS產量達到最大值;隨后,繼續增加溫度,EPS產量呈現降低的趨勢,但差異不顯著。因此,選擇34 ℃作為菌株TT207產胞外多糖的最適發酵溫度。

2.5.2 初始pH對EPS產量的影響 pH影響微生物對營養物質吸收的同時,還會影響菌體的生長及其代謝產物的合成,因此通過調節發酵液初始pH以降低對菌體的不利影響[22]。如圖6B所示,當初始pH在6.0～6.5之間,EPS產量明顯增加,初始pH>6.5之后,EPS產量逐漸減少,因此,選擇菌株TT207產EPS的最適初始發酵液pH6.5。

2.5.3 接種量對EPS產量的影響 接種量直接影響發酵液中的最初活菌數、菌體發酵周期及其代謝水平,從而影響菌體的生長以及EPS的合成[23]。如圖6C所示,菌株TT207的接種量在2%～4%之間,其EPS產量隨接種量的增大而增加;接種量在4%～10%之間,EPS產量隨接種量的增大而減少;當接種量為4%時,EPS產量達到最大值。因此,選擇4%作為菌株TT207的最適接種量。

2.5.4 裝瓶量對EPS產量的影響 裝瓶量影響發酵過程中菌株的通氣狀況,適宜的溶氧狀況是影響菌體生長及其合成代謝產物的關鍵。如圖6D所示,菌株TT207在裝瓶量為70 mL/250 mL時,EPS產量達到最大值,因此,選擇70 mL/250 mL作為菌株TT207的最適裝瓶量。

2.5.5 搖床轉速對EPS產量的影響 搖床轉速會影響供氧量,從而影響菌體的代謝能力及其EPS產量。降低搖床轉速會導致發酵液中溶氧量降低,使EPS產量減少;反之,升高搖床轉速使發酵液中溶氧量增加,菌體生長與代謝速率升高,促進EPS產量的增加。若搖床轉速過高,會引發菌體機械性損傷,導致菌體自溶,從而抑制EPS合成[24]。如圖6E所示,搖床轉速在120～140 r/min之間,菌株TT207的EPS產量隨著搖床轉速的增大而增加。當搖床轉速為140 r/min時,EPS產量達到最大值。繼續增大搖床轉速,EPS產量隨搖床轉速的增大而減少。因此,選擇140 r/min作為菌株TT207的最適搖床轉速。

圖6 發酵條件對EPS產量的影響Fig.6 Effect of fermentation condition on EPS production注:A:溫度;B:初始pH;C:接種量;D:裝瓶量;E:搖床轉速。

微生物合成次級代謝產物的能力與發酵條件緊密相關,其直接影響代謝方式及代謝物產量,從而影響目的產物產量[25]。因此,確定菌株TT207的最適發酵條件,能夠大幅提高其EPS產量。經優化,得到菌株TT207的最佳發酵條件為培養時間48 h,培養溫度34 ℃,初始pH6.5,接種量4%,裝瓶量70 mL/250 mL,搖床轉速140 r/min。

2.6 發酵培養基組分的優化

2.6.1 碳源種類及其添加量對EPS 產量的影響 碳源作為細胞生長最重要的能量與營養來源,能夠顯著影響EPS產量及其化學組成[18]。如圖7A所示,菌株TT207可分別利用葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘油、甘露醇和可溶性淀粉這7種碳源生長并合成EPS,但蔗糖作為碳源時的EPS產量顯著高于其他碳源條件下的EPS產量(P<0.05)。因此,選擇蔗糖為最適碳源進行后續研究。

當碳源濃度過低時,不足以提供細胞成長所需的營養,影響細胞生長,從而導致EPS產量降低;但在高濃度下,由于存在碳源阻遏效應[19],影響EPS的合成,只有在適宜的濃度下,細胞生長與碳源阻遏效應達到平衡,菌株合成EPS的能力才會達到最大。如圖7B所示,蔗糖添加量在5～45 g/L時,菌株TT207的EPS產量隨蔗糖添加量的增大而顯著增加(P<0.05)。蔗糖添加量大于45 g/L后,EPS產量增幅減緩。出于后續工業化生產中成本的考慮,選擇45 g/L作為菌株TT207的最適蔗糖添加量。

2.6.2 氮源種類及其添加量對EPS產量的影響 氮源作為微生物生長不可或缺的一類能源物質,主要用于微生物的氨基酸、蛋白質和核酸等細胞物質的合成,是微生物生長繁殖及其次級代謝產物合成過程中必需的營養物質。氮源的種類和添加量不僅影響EPS的產量,而且影響其相對分子質量[20]。如圖7C所示,菌株TT207可分別利用酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、胰蛋白胨、NaNO3、KNO3、NH4NO3、NH4Cl和尿素這9種氮源生長并合成EPS,但利用無機氮源合成EPS的能力明顯高于有機氮源。其中,當KNO3作為氮源時的EPS產量顯著高于其他氮源條件下的EPS產量(P<0.05)。因此,選擇KNO3為最適氮源進行后續研究。

在高濃度下,氮源供能后生成的銨態氮或硝態氮對菌株具有一定的毒害作用,從而抑制胞外多糖的積累[21]。如圖7D所示,KNO3添加量在2～8 g/L時,菌株TT207的EPS產量隨KNO3添加量的增大而增加,KNO3添加量為8 g/L時,EPS產量達到最大值,繼續增加KNO3添加量,EPS合成受到抑制,EPS產量隨之減少。因此,選擇8 g/L作為菌株TT207的最適KNO3添加量。

圖7 營養條件對EPS產量的影響Fig.7 Nutritional condition on EPS production注:A:碳源種類;B:蔗糖添加量;C:氮源種類;D:KNO3添加量;E:無機鹽種類;F:KH2PO4添加量。

2.6.3 無機鹽種類及其添加量對EPS 產量的影響 除碳、氮源外,微生物的生長、代謝還需無機鹽提供多種重要元素。如圖7E所示,菌株TT207可分別利用NaCl、KH2PO4、K2HPO4、CaCl2、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O這6種無機鹽生長并合成EPS,但在KH2PO4作為無機鹽時的EPS產量顯著高于其他無機鹽條件下的EPS產量(P<0.05)。因此,選擇KH2PO4為最適無機鹽進行后續研究。

如圖7F所示,KH2PO4添加量在2～6 g/L時,菌株TT207的EPS產量隨KH2PO4添加量的增大而增加,在KH2PO4添加量為6 g/L時,EPS產量達到最大值。之后,EPS產量隨KH2PO4添加量增大逐漸減少。因此,選擇6 g/L作為菌株TT207的最適KH2PO4添加量。

2.7 正交實驗結果

根據單因素實驗結果,初步確定菌株TT207的最佳發酵培養基組分為:蔗糖45 g/L,KNO38 g/L,KH2PO46 g/L;最佳發酵條件為48 h,34 ℃,初始pH6.5,接種量4%,裝瓶量70 mL/250 mL,搖床轉速140 r/min。因此,在最佳發酵條件下,以蔗糖、KNO3、KH2PO4這三個因素作為實驗因子,采用L9(34)設計表進行正交實驗,進一步對菌株TT207的發酵培養基組分進行優化。每個實驗水平均重復3次,對應的EPS產量取3次實驗結果的平均值,結果見表5。根據表5所示極差的大小,可以判斷碳源、氮源和無機鹽中,對影響EPS產量的主次順序依次為C>A>B,即KH2PO4>蔗糖>KNO3。

表5 L9(34)正交實驗結果Table 5 The results of L9(34)orthogonal test

表6 方差分析結果Table 6 The result of analysis of variance

注:R2=0.980(調整R2=0.921)。

2.7.1 方差分析 方差分析結果如表6所示,碳源、氮源和無機鹽三個因素中,KH2PO4對菌株TT207合成EPS的影響顯著。綜合比較各因素不同水平下的EPS產量,9組實驗中的最優組合為A1B3C3,即蔗糖40 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。根據均值分析,可得出A3B3C3為本實驗的最優組合,即蔗糖50 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。因此,需要進行驗證實驗,確定菌株TT207合成EPS的最優碳源、氮源和無機鹽的組合。

2.7.2 驗證實驗 驗證實驗結果如表7所示,在最適培養條件下,組合A3B3C3的EPS產量高于組合A1B3C3,因此確定A3B3C3為菌株TT207合成EPS的最優組合,即蔗糖50 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。在最佳發酵條件下,菌株TT207的EPS產量達到12.39 mg/mL,較優化前基礎培養基培養的胞外多糖產量(1.76 mg/mL)提高了6.04倍。

表7 驗證實驗結果Table 7 The results of confirmatory

3 結論

本研究從實驗室保藏的6株產胞外多糖的沙棘根瘤內生細菌中,篩選出了1株胞外多糖產量較高的菌株TT207,并對其進行鑒定。通過形態學特征觀察、生理生化試驗結果以及16S rRNA基因序列分析,將菌株TT207鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。為進一步提高菌株TT207的EPS產量,對其培養基組分與發酵條件進行了優化。利用單因素實驗,確定菌株TT207的最佳培養基組分為:蔗糖45 g/L,KNO38 g/L,KH2PO46 g/L;最佳發酵條件為:培養時間48 h,培養溫度34 ℃,初始pH6.5,接種量4%,裝液量70 mL/250 mL,搖床轉速140 r/min。在此基礎上,通過正交實驗設計,進一步優化菌株TT207的發酵培養基組分,并考察各因素對該菌株合成EPS的影響,最終得出培養基組分的最優組合為:蔗糖50 g/L,KNO310 g/L,KH2PO48 g/L。經優化,菌株TT207的EPS產量達到12.39 mg/mL,較優化前提高了6.04倍。研究發現,沙棘根瘤內生枯草芽孢桿菌具有高產胞外多糖的潛力,本文為其工業化生產提供了一定的理論依據和技術支持。但其生物學功能尚未清楚,還需進一步研究探討。