胡椒油中萜類化合物對單增李斯特菌抑菌機理及在冷鮮肉中的應用

李兆亭,陳文學,韓迎潔,孫志昶

(海南大學食品學院,海南?？?570228)

單核細胞增生李斯特菌(L.monocytogenes),簡稱單增李斯特菌,在自然界中廣泛存在,是一種常見的食源性病原體。它具有很強的生存能力,可以在低溫、酸性和高鹽環境中繼續生長。對于低溫肉類產品,特別是依賴冷鏈和嚴格衛生條件的冷鮮肉以及熟肉制品,如果不進行二次滅菌延長保質期,很容易造成安全隱患[1]。

食品保鮮劑按來源可以分為化學合成保鮮劑和天然保鮮劑,目前市場上以化學抑菌劑為主,化學保鮮劑雖然能起到良好的保鮮效果,但一些化學保鮮劑本身存在著致畸致癌性,長期使用會對人體造成危害[2]。天然保鮮劑具有安全、無毒、廣譜抑菌等優點,在肉制品工業中具有廣闊的應用前景[3]。此外,隨著人們對健康的關注,消費者對食品安全的要求不斷提高,尋找能替代化學保鮮劑的天然保鮮劑已成為當今研究的熱點[4-5]。

胡椒屬于藥食同源的植物材料之一,胡椒中揮發油的含量達4.5%以上,胡椒揮發油對鼠傷沙門氏菌、葡萄球菌和大腸桿菌均有抑制作用[6-7]。胡椒油主要成分為萜類化合物,占胡椒油的78.92%,具有抗病毒、細菌、真菌,抗腫瘤,預防心血管疾病以及松弛平滑肌等多種生物活性[8-9]。目前,大多數研究僅討論天然保鮮劑的宏觀抑菌性能,而關于胡椒中萜類化合物對單增李斯特菌的抑菌機理以及在冷鮮肉中的應用鮮有報道。因此,本研究將胡椒油中萜類化合物作為保鮮劑,探究其對單增李斯特菌的抑菌機理以及冷鮮肉的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胡椒粉 海南省?？谑心蠂?冷鮮豬肉 羅牛山股份有限公司;單增李斯特菌(ATCC19115) 廣東環凱微生物科技有限公司;胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB) 廣東環凱微生物科技有限公司;瓊脂 北京Solarbio科技有限公司;磷酸二氫鈉 山東西亞化學股份有限公司;磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉 西隴科學股份有限公司;改良牛津培養基(MOX) 上海谷研實業有限公司。

TP-313電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZB125切碎機 諸城華杰機械有限公司;RE52CS旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;DKZ電熱恒溫震蕩水槽 上海一恒科技有限公司;FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;S3000掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;7890B-7000B氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS) 美國安捷倫科技有限公司;UV752N紫外可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 胡椒油中萜類化合物的提取 參考王延輝等[10]、鄒蘭等[11]的方法采用蒸餾萃取(SDE)法提取胡椒中的萜類化合物。SDE條件:取50 g胡椒粉末置于500 mL的圓底燒瓶中,加入200 mL超純水和少量玻璃珠。接收端裝90 mL沸程90～120 ℃石油醚,85 ℃恒溫水浴提取60 min。萃取后上層有機相過50 g無水硫酸鈉柱,濾液經旋轉蒸發儀濃縮后制得萜類化合物粗提物。

1.2.2 萜類化合物化學成分的測定 取0.1 mL胡椒油用正己烷定容至5 mL,取1.5 mL至進樣瓶。參考Cui等[12]的方法,色譜柱:HP-5彈性石英毛細管(30 m×0.25 mm,0.33 μm);柱溫:60～200 ℃(5 ℃/min);汽化室溫度230 ℃;溶劑延遲4 min;傳輸線溫度230 ℃;進樣量0.2 μL;載氣(He)流量2 mL/min;分流比40∶1。LS質譜條件EI離子源;離子源溫度230 ℃;電離能量70 eV;發射電流34.6 μA;電子倍增器電壓120 V;質量范圍:20～500 amu。使用氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)測定和分析胡椒油中的化學成分。

1.2.3 單增李斯特菌的活化 單增李斯特菌凍干粉和腦心浸液混勻后,取5 μL接種到含有5 mL滅菌TSB肉湯培養基的試管中。參考金源[13]的方法,將試管包裹后37 ℃恒溫振蕩(80 r/min)培養16 h。在TSB肉湯培養基中傳代三次后,通過平板劃線純化菌株。將菌落接種在瓊脂平板上,然后將平板置于37 ℃培養箱中16～24 h,挑取單個菌落并在無菌條件下接種到含有TSB肉湯培養基的試管中,再次培養過夜制得菌懸液,4 ℃存儲備用。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定 參考劉雪等[14]的方法將胡椒油加入含有TSB肉湯培養基的試管中,分別得到0.00625%、0.0125%、0.025%、0.05%、0.1%和0.2%(V/V)的濃度。隨后,取0.2 mL活化后的菌液于平板上涂布均勻。以無菌水作為空白對照,將各平板于37 ℃中倒置培養24 h,以完全不長菌的最小濃度確定為胡椒油對單增李斯特菌作用的MIC。

1.2.5 細胞裂解程度的測定 將活化后的單增李斯特菌在TSB中培養,在37 ℃溫育24 h。將懸浮液在4 ℃條件下4000 r/min離心15 min并收集沉淀。將沉淀物用無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌三次并重懸浮以制備108CFU/mL(600 nm波長處的吸光值為0.1)的細菌懸浮液。根據1.2.4得出的MIC分別添加萜類化合物,使其濃度分別為0%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%,振蕩(150 r/min,37 ℃)培養20 h。將懸浮液在4 ℃下以4000 r/min離心15 min,并通過微孔膜濾器過濾上清液,通過紫外分光光度計在260 nm處測定濾液的吸光度[15-16]。

1.2.6 萜類化合物抑菌的最優濃度 實驗組用無菌PBS將胡椒油稀釋到試管中,分別得到濃度為0.05%、0.10%、0.15%和0.20%的萜類化合物,對照組用等量蒸餾水代替萜類化合物。隨后,參考Nakayama等[17]的研究方法,取1.2.5中菌液(108CFU/mL),用無菌鹽水稀釋至103CFU/mL,取1 mL接種在瓊脂培養基中,并在150 r/min和37 ℃下培養。通過平板計數的方法,分別在培養的0、1、2、4、8、16 h計數活細菌的數目。

1.2.7 掃描電子顯微鏡(SEM)觀測 參考Diao等[18]的方法,通過SEM觀察單增李斯特菌形態。取活化后的單增李斯特菌菌液0.1 mL接種于200 mL TSB液體培養基中,根據1.2.5和1.2.5中得出萜類化合物抑菌的最優濃度,在實驗組加入0.2 mL胡椒油并在搖床上振蕩培養(37 ℃、150 r/min、24 h),對照組不添加胡椒油。取培養12和24 h的菌懸液,6000 r/min離心10 min收集菌體。先后用0.1 mol/L PBS、20%、40%、60%、80%的乙醇和無水乙醇進行洗脫。脫水后的樣品在-20 ℃條件下預凍12 h后冷凍干燥12 h,SEM觀察其細胞形態。

表1 胡椒油中主要萜類化合物的化學組成Table 1 Chemical composition of major terpenoids in pepper oil

表2 胡椒油中萜類化合物最小抑菌濃度的測定Table 2 Determination of minimum inhibitory concentration of terpenoids in pepper oil

注:-代表無菌落;+代表少量菌落;++代表較多菌落;+++代表大量菌落。

1.2.8 菌液電導率的測定 參考張新虎等[19]的方法,取活化后的單增李斯特菌用無菌PSB(pH=7.4)洗滌3次,根據1.2.5和1.2.6中得出萜類化合物抑菌的最優濃度,取菌液與0.1%胡椒油溶液混合作為試驗組(EG),對照組(CG)不添加胡椒油,每隔2 h測定1次電導率,連續12 h。

1.2.9 胡椒油中萜類化合物對冷鮮肉中的保鮮作用 取60 g冷鮮肉,加入140 mL 生理鹽水,用均質機制成勻漿,煮沸2 min后過濾,每10 mL濾液分裝于試管中,121 ℃ 15 min高溫滅菌后各加入10 μL菌懸液。隨后,根據1.2.5和1.2.6中得出萜類化合物抑菌的最優濃度,實驗組(EG)添加10 μL胡椒萜類化合物,對照組(CG)加入10 μL蒸餾水。將樣品在4 ℃條件下存儲24 h,每隔6 h取100 μL溶液至MOX選擇性培養基,37 ℃培養48 h以計數單增李斯特菌。

1.3 數據處理

每組試驗做3次重復實驗。方差分析:SPSS 19.0軟件對數據進行t檢驗;圖形制作:Origin 8.0。

2 結果與分析

2.1 胡椒油化學成分分析

胡椒揮發油的提取方法有冷壓榨法、有機溶劑浸取法、水蒸氣蒸餾法、索氏提取法、超聲波法、超臨界CO2萃取等[20-22]。蒸餾-萃取法是近些年來發展起來的揮發性成分分離方法,具有設備簡單、操作容易、溶劑用量小、揮發油的回收率較高等優點。本研究采用蒸餾萃取的方法提取黑胡椒中的揮發油,鑒定出14個化合物,其中萜類化合物12種,占總檢出量的77.60%，主要萜類化合物組成及比例見表1。其中檸檬烯主要存在于橘皮精油中的單環單萜烯，常溫下是一種無色至淡黃色油狀液體,具有特異的檸檬樣香氣,不溶于水,易溶于乙醇等有機溶劑。

2.2 胡椒油中萜類化合物對L. Monocytogenes的MIC

表2可知,胡椒油中萜類化合物對單增李斯特菌具有較強抑菌作用,MIC為0.05%,隨著萜類化合物濃度的提高,其抑菌能力增強。細菌經萜類化合物作用后外膜分解,細胞壁大幅度增厚或分解,表面的粗糙度增加,細胞質減少。檸檬烯可透過線粒體膜,使菌體的細胞器和相同離子滲出過程中的滲透率更大[23]。有關研究指出檸檬烯對金黃色葡萄球菌的MIC為0.05%,10 mL/L的檸檬烯可顯著抑制銅綠假單胞菌生長[14,24]。

2.3 胡椒中萜類化合物對單增李斯特菌細胞裂解程度的影響

用萜類化合物處理細菌后,測量其在260 nm處的吸光度作為細菌裂解的指標[25]。如圖1所示,隨著萜類化合物濃度的增加,單增李斯特菌的吸光度增加,即細菌裂解程度增加。0.10%萜類化合物處理后的吸光度顯著高于對照組和0.05%萜類化合物處理組(P<0.05),而與0.15%和0.25%萜類化合物處理后吸光度沒有顯著差異,這說明萜類化合物對單增李斯特菌的最優抑菌濃度為0.10%,可使得維持細菌生命所需的細胞內成分流失,最終導致菌體死亡。

圖1 胡椒油中萜類化合物處理后L. monocytogenes菌懸液吸光度的變化Fig.1 Changes in absorbance of L. monocytogenes suspension after treatment with terpenoids in pepper oil注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 胡椒油中萜類化合物的抗菌活性

加入不同濃度萜類化合物后0～16 h內單增李斯特菌的生長曲線如圖2所示,萜類化合物對單增李斯特菌具有良好的抗菌活性。從圖2中可以看出,對照組中單增李斯特菌的菌落數不斷增加,實驗組單增李斯特菌的菌落數先增加后減少。在處理4 h后,0.1%、0.15%和0.2%之間的菌落數無顯著差異,但均顯著低于0.05%的菌落數(P<0.05)。

圖2 胡椒油中萜類化合物對L. monocytogenes的抗菌活性Fig.2 Antibacterial activity of terpenoids in pepper oil against L. monocytogenes

2.5 掃描電鏡下單增李斯特菌的形態

由SEM的結果可以清楚地看到單增李斯特菌在萜類化合物作用前后結構的變化(圖3)。SEM顯示不與萜類化合物相互作用的細菌細胞結構是完整的。萜類化合物處理12 h后,單增李斯特菌之間相互黏連,24 h后細菌大面積溶解,基本無法看到完整的細胞結構。這可能是由于檸檬烯的親脂活性,結合細胞膜上的磷脂從而使細胞膜結構發生改變[26]。有關報告指出植物精油能夠破壞微生物DNA的結構,進而抑制基因表達,影響微生物的正常生命活動及繁殖[27]。但目前植物精油對微生物DNA的影響還處于初步研究階段,具體的作用位點和作用方式還不明確,有待進一步的研究[28]。

圖3 掃描電鏡下單增李斯特菌的形態Fig.3 L. monocytogenes morphology under scanning electron microscope注:A、B分別表示12和24 h對照組細菌形態,C、D分別表示12和24 h實驗組細菌形態。

2.6 萜類化合物對單增李斯特菌電導率的影響

在細菌受到強抑菌物質的作用時,菌體的細胞膜遭到破壞,失去原有保護能力,細胞內有帶電離子等溶出,內部電解質向外泄露到培養液中,導致培養液的電導率增加。因此,細菌細胞膜通透性的變化可以通過菌液電導率值的變化來反映[29]。由圖4可知,隨著時間的增加,實驗組和對照組單增李斯特菌菌液的電導率均增加。這意味著細胞膜的滲透性增加,導致細胞內成分的滲漏,特別是電解質的損失。在6～12 h,添加0.1%萜類化合物菌液電導率顯著高于對照組(P>0.05),原因可能是0.1%的萜類化合物對細胞膜的破壞使電解質大量外滲。王亞麗等[30]的研究顯示,藍莓葉多酚也能夠增加單增李斯特菌細胞膜的通透性。王帆等[31]指出,茶樹精油會導致單核細胞增生李斯特菌的穿孔膜損傷,并大大改變膜的滲透性。

圖4 胡椒油中萜類化合物對單增李斯特菌電導率的影響Fig.4 Effect of terpenoids in pepper oil on the conductivity of L. monocytogenes

2.7 胡椒油中萜類化合物對冷鮮肉的保鮮作用

冷鮮肉在分割和貯存過程中很容易被致病菌污染。0.10%萜類化合物對冷鮮豬肉的抗菌活性如圖5所示。結果表明,萜類化合物對冷鮮肉中的單增李斯特菌抑制作用明顯,與對照組相比,加入萜類化合物后冷鮮肉中的單增李斯特菌生長緩慢。此外,對照組的菌落數在冷藏12 h后已超過冷鮮肉國家標準(菌落總數大于6.0 lg CFU/g為變質肉),但在加入0.10%萜類化合物后24 h仍然處于較低水平。

圖5 胡椒油中萜類化合物對冷鮮肉菌落總數的影響Fig.5 Effect of terpenoids in pepper oil on the total colony number of fresh meat

3 結論

本研究探討了胡椒油中萜類化合物對單增李斯特菌抑菌活性的影響,發現胡椒揮發油中含有12種萜類化合物，其MIC為0.05%，0.1%萜類化合物對單增李斯特菌顯示出非常好的抑菌活性。萜類化合物使得單增李斯特菌的細胞膜通透性增加,細胞內容物大量外溢,細胞破碎溶解。萜類化合物在冷鮮肉中抑菌效果明顯，加入0.1%萜類化合物后菌落數在冷藏后24 h仍然處于較低水平。胡椒作為一種天然安全植物的香料,在制備保鮮劑方面具有廣闊的應用前景。