糙米多酚對淀粉消化酶的抑制作用及機理

黃克愁1,黃 澳1,黃奕瑜1,羅舜菁1,曾子聰1,戴濤濤1,羅舜芬

(1.南昌大學食品學院,食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.贛南師范大學圖書館,江西贛州 341000)

糙米作為一種全谷物,含有豐富的植物化學物質(zhì),例如維生素、礦物質(zhì)、酚類物質(zhì)、纖維和一些其它活性物質(zhì),因具有潛在的保健作用而受到關(guān)注[1]。糙米中含有豐富的酚類物質(zhì),研究表明多酚具有抗氧化、抑菌、抑制淀粉消化酶活性等多種生理功能,是目前研究的熱點[2]。

淀粉消化酶類主要包括α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶等,此類酶能從碳水化合物分子鏈非還原性末端依次切開α-l,4糖苷鍵,并能緩慢水解α-l,6糖苷鍵,最終將碳水化合物水解為葡萄糖單糖,利于食物的消化吸收,影響細胞表面復合糖質(zhì)的形成[2]。淀粉消化酶抑制劑能有效抑制α-葡萄糖苷酶或α-淀粉酶的活性,延緩食物中碳水化合物的水解和消化,降低餐后血糖水平,從而達到改善糖尿病的目的[3-5]。Yang等[6]指出紅米、黑米和紫米多酚對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,且黑米多酚抑制作用最強,其半抑制濃度為(13.6±1.2) mg/mL。Rasouli等[7]通過分子模擬技術(shù)篩選出26種多酚,它們均能與淀粉消化酶發(fā)生相互作用,其中花青素、表兒茶素、槲皮素和丁香酸等13種多酚能顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性,另外推斷出兒茶素、山奈酚和天竺葵素是有效的α-淀粉酶抑制劑。Peng等[8]研究發(fā)現(xiàn),多酚能夠通過氫鍵和范德華力與α-葡萄糖苷酶活性位點的氨基酸殘基結(jié)合,誘導酶的重排和構(gòu)象變化,阻止底物進入，從而抑制酶的活性。盡管近年來有研究報道大米多酚對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用,但大部分為有色米多酚或者多酚標準品。糙米作為日常生活中最為普遍的全谷物,糙米多酚(brown rice polyphenols,BRP)對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用及機理的研究還鮮有報道。

本文將BRP經(jīng)過提取和C18固相柱純化后,利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS)分析BRP的主要成分,然后研究了BRP純化物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并通過熒光光譜研究了BRP與消化酶之間的相互作用,從而為延緩碳水化合物的水解、改善餐后血糖提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

秈糙米 江西新龍糧油有限公司;α-葡萄糖苷酶(≥10 U/mg) Sigma-Aldrich公司,來源于釀酒酵母;α-淀粉酶(≥5 U/mg) Sigma-Aldrich公司,來源于豬胰腺;對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)(純度>98.0%) Solarbio公司;阿卡波糖片拜唐蘋 當?shù)厮幍?所有分離用有機溶劑 均為國產(chǎn)分析純。

F-7000型日立熒光分光光度計 日本Hitachi公司;LC-30超高效液相色譜儀 日本島津公司;TripleTOF 5600+質(zhì)譜儀 美國AB Sciex公司;TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析有限公司;Multiskan MK3多功能酶標儀 美國Thermo Fisher科技公司;FreeZone 12-Plus冷凍干燥機 美國Labconco公司;Anke LXJ-IIB TGL-16C離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 BRP的提取純化 提取:參照Tian等[9]的方法,并做適當?shù)男薷摹Ｈ∵m量粉碎后過60目篩的糙米粉,加入正己烷(1∶5,W/V)攪拌脫脂30 min,2500×g離心5 min去除上清液,沉淀重復脫脂2次。室溫下向脫脂后的沉淀中加入70%乙醇(1∶5,W/V)攪拌提取,每次30 min,2500×g離心5 min,取上清液。上述提取操作重復兩次,合并上清液,45 ℃旋蒸去除有機溶劑,此為BRP粗提液。

純化:將上述BRP粗提液采用Sep-Pak? Vac 20 cc(5 g)C18固相萃取柱進行純化,具體操作步驟如下:對C18固相萃取柱進行預(yù)處理,即采用20 mL甲醇沖洗以活化固相萃取柱,接著用40 mL去離子水對C18固相萃取柱進行沖洗以平衡固相萃取柱。進行上樣操作,取10 mL BRP粗提液加入到平衡后的固相萃取柱中,并用40 mL甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶9,V/V)進行沖洗,以除去樣品中的雜質(zhì)。采用40 mL甲醇水溶液(甲醇∶水=8∶2,V/V)對固相萃取柱進行洗脫,棄去前2 mL洗脫液,收集剩余洗脫液,然后置于45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),去除有機溶劑,即為BRP純化液,將上述BRP純化液置于4 ℃冰箱中,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BRP組分鑒定 參照Zeng等[10]的方法,BRP的組分分析采用島津LC-30超高效液相系統(tǒng)并配有二元泵和二極管陣列檢測器。色譜分離在室溫下進行,色譜柱采用Shim-pack GIST C18柱(75 mm×2.1 mm,2 μm),流動相由0.1%甲酸(溶劑A)和乙腈(溶劑B)組成,并按以下步驟進行梯度洗脫:0～2 min,10% B;2～15 min,10%～20% B;15～20 min,20%～30% B;20～38 min,30%～40% B;38～40 min,40%～100% B;40～50 min,100% B;50～50.1 min,100%～10% B;50.1～55 min,10% B。使用自動樣器進樣,進樣量為10 μL,流速為0.3 mL/min。質(zhì)譜分析采用配備有電噴霧電離源(ESI)的飛行時間質(zhì)譜儀(TripleTOF 5600+,AB Sciex,USA)。主要操作參數(shù)設(shè)置如下:空氣為載氣,氮氣用作霧化和輔助氣,優(yōu)化值分別設(shè)置為30、50和50 psi;離子源的溫度為550 ℃;噴霧電壓5 kV;去簇電壓80 V;碰撞能(35±15) eV;電離模式為正離子模式;數(shù)據(jù)采集采用信息關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)采集模式(IDA),并在m/z 50～1000范圍內(nèi)獲得質(zhì)譜信息,并用MasterView 1.0和PeakView 2.1軟件(AB Sciex,USA)進行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.2.3 淀粉消化酶抑制率實驗

1.2.3.1α-淀粉酶抑制活性 參考劉杰超等[11]的方法,并進行優(yōu)化。用PBS溶液將BRP配制成0.01～0.4 mg/mL溶液,并以阿卡波糖片為陽性對照,PBS溶液為陰性對照。取0.25 mLα-淀粉酶溶液加入25 mL比色管中,然后加入0.5 mL 0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2和0.4 mg/mL的一系列的BRP溶液或阿卡波糖和PBS溶液,混合均勻后,37 ℃水浴10 min,然后加入0.5 mL 1%的淀粉溶液啟動反應(yīng),37 ℃ 水浴中反應(yīng)10 min后,加入1 mL DNS溶液,沸水浴中反應(yīng)5 min,取出冷卻后定容至10 mL,最后于540 nm處測定樣品吸光值。試驗重復3次,每次3個復管,抑制率按以下公式進行計算:

式中:A1為BRP和α-淀粉酶反應(yīng)后的吸光度;A2為只加BRP反應(yīng)后的吸光度;A3為只加酶和底物反應(yīng)后的吸光度;A4為只加入底物反應(yīng)后的吸光度。

1.2.3.2α-葡萄糖苷酶抑制活性 參考Yang等[12]的方法,用PBS(0.1 mol/L,pH6.8)溶液將BRP和阿卡波糖片配制成0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00和2.00 mg/mL的一系列樣品溶液。其中阿卡波糖片為陽性對照,PBS溶液為陰性對照。首先將50 μL BRP溶液、陽性對照和陰性對照分別加入96孔板中,然后加入100 μLα-葡萄糖苷酶(0.25 U/mL)混合。樣品在25 ℃下?lián)u床孵育10 min后,加入50 μL 4 mmol/L p-NPG底物啟動反應(yīng),反應(yīng)5 min,立即在405 nm處測定吸光度,計算抑制率。酶抑制試驗重復3次,每次6個復孔。

式中:A1為BRP和α-葡萄糖苷酶反應(yīng)后的吸光度;A2為只加BRP反應(yīng)后的吸光度;A3為只加酶和底物反應(yīng)后的吸光度;A4為只加入底物反應(yīng)后的吸光度。

1.2.4 熒光光譜測定 參照Dong等[13]的研究方法,掃描波長為290～500 nm,激發(fā)波長為295 nm,狹縫寬度均為2.5 nm。在濃度為2.423×10-6mol/L的3.0 mLα-葡萄糖苷酶溶液中連續(xù)滴加濃度為0.5 mg/mL的BRP溶液(終濃度為16.67×10-3mg/mL),混勻,3 min后測量這些混合溶液的熒光強度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

上述測定均重復3次,并采用SPSS 22.0和Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析,實驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 BRP的組分鑒定

提取得到的BRP經(jīng)過純化后,采用UPLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS對多酚組分進行分析,并將實驗結(jié)果與現(xiàn)有研究和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(Metlin和Massbank)中的信息進行匹配,對比保留時間以及MS/MS質(zhì)譜圖對多酚組分進行鑒定。其液相譜圖如圖1所示,對應(yīng)的質(zhì)譜鑒定信息如表1所示。結(jié)果表明,與大多數(shù)其它植物成分一樣,糙米中的酚類化合物可以作為游離苷元或者糖苷形式存在,且后者在自然界中更為常見。然而,現(xiàn)有的關(guān)于糙米酚類鑒定的研究主要集中在游離苷元及其聚合物的分析,關(guān)于多酚糖苷的研究較少。本實驗共鑒定了27種多酚化合物,包括2種酚酸酰胺、6種酚酸、4種酚酸糖苷、6種酚酸酯、1種酚醛和8種黃酮糖苷[14-19](表1)。

圖1 BRP的高效液相色譜圖(280 nm)Fig.1 UPLC chromatogram(280 nm)of phenolic extracts of brown rice

2.2 BRP對淀粉酶的抑制作用

圖2為BRP和阿卡波糖分別對α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制作用效果圖。由圖2可知,BRP對α-淀粉酶無明顯的抑制作用,而對α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著BRP濃度的增加呈上升趨勢,最高可達39.37%,說明BRP對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制能力,但BRP對α-葡萄糖苷酶的整體抑制效果均低于同濃度的阿卡波糖。

圖2 BRP和阿卡波糖對α-淀粉酶(A)和α-葡萄糖苷酶(B)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of brown rice polyphenols andacarbose on α-amylase(A)andα-glucosidase(B)

BRP對淀粉消化酶的抑制作用主要與多酚的含量及其組成有關(guān)[19]。稻米中的多酚類物質(zhì)主要集中在米糠中,有研究表明米糠中多酚含量是糙米的4～10倍[20-22],因此現(xiàn)有的研究大多為米糠提取物對消化酶的影響。Wu等[19]研究了不同品種米糠多酚提取物對淀粉消化酶的抑制活性,結(jié)果表明黑米、秈米和粳米米糠的多酚提取物中均含有豐富的槲皮素、蘆丁等黃酮類物質(zhì),因此對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶均有較強的抑制作用。但Boue等[23]的研究發(fā)現(xiàn),普通糙米米糠提取物對兩種酶均無明顯抑制作用,主要原因可能是不同品種米糠中多酚組成存在較大差異。

表1 BRP的組分鑒定Table 1 Components identification of BRP

有研究表明阿魏酸[24]、咖啡酸[25]和對香豆酸[26-27]等酚酸物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用,本研究以全谷物糙米為研究對象,多酚組分分析結(jié)果表明,BRP中含有一定量的游離酚酸,因此表現(xiàn)出一定程度的α-葡萄糖苷酶抑制活性(最高抑制率為39.37%)。此外,BRP中主要為酚酸和黃酮類的衍生物,且主要以C-糖苷和O-糖苷的形式存在,因此BRP對α-淀粉酶的抑制作用較小,這與Boue等[23]的研究結(jié)果一致。

2.3 BRP對α-葡萄糖苷酶的作用機制

為了研究BRP對α-葡萄糖苷酶抑制作用的作用機制,利用α-葡萄糖苷酶自身內(nèi)源熒光作為探針,通過α-葡萄糖苷酶熒光強度的變化解釋BRP對α-葡萄糖苷酶的作用機制。圖3表示在298、304、310 K,pH6.8的條件下,隨著BRP濃度的增加(a～k依次增大)內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的變化。從圖3中可以看出,復合體系的最大發(fā)射波長為336 nm,隨著BRP的不斷加入,復合體系的熒光峰值強度逐漸降低,表明二者之間發(fā)生了相互作用,從而對α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了強烈的猝滅作用。

圖3 不同濃度BRP對α-葡萄糖苷酶內(nèi)源熒光的猝滅光譜圖Fig.3 Quenching spectra of endogenous fluorescence of α-glucosidase with different concentrations of BRP

2.3.1α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的類型 熒光猝滅機制通常可以分為3種:動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和靜動態(tài)混合猝滅[28]。動態(tài)猝滅是猝滅劑和熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子之間的相互作用過程,其作用過程遵循Stern-Volmer 方程:

式(1)

式中：F0和F分別代表加入BRP之前和加入之后α-葡萄糖苷酶的熒光強度;[Q]代表BRP的濃度;τ0(10-8s)是未添加BRP時熒光發(fā)色基團的壽命;KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù);Kq為猝滅速率常數(shù)。

圖4為不同溫度下以F0/F-1對BRP濃度進行的曲線擬合圖。由圖4可知,F0/F-1與BRP的濃度呈良好的線性關(guān)系,表明BRP對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅是單一的靜態(tài)猝滅或者動態(tài)猝滅。根據(jù)公式(1)可以求出三個不同溫度下的熒光猝滅速率常數(shù)KSV分別是18.3、20.6和24.3 L·g-1,且隨著溫度的升高而增加,因此,BRP對α-葡萄糖苷酶的猝滅過程是由分子碰撞引起的動態(tài)猝滅,BRP可能與α-葡萄糖苷酶中的色氨酸基或酪氨酸基結(jié)合形成了某種具有特定結(jié)構(gòu)的復合體系。

圖4 不同溫度下BRP對α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖Fig.4 Stern-Volmer quenching fluorescence of α-glucosidase by BRP at different temperatures

2.3.2 BRP與α-葡萄糖苷酶相互作用的熱力學參數(shù)和作用力類型 BRP與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點數(shù)可通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程進行分析:

式(2)

式中:[Q]和[Pt]分別表示BRP和α-葡萄糖苷酶的總濃度;Ka表示結(jié)合常數(shù);n表示α-葡萄糖苷酶分子的結(jié)合位點數(shù)。

表2 不同溫度下BRP對α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅常數(shù)KSV,結(jié)合常數(shù)Ka和相互作用的熱力學參數(shù)Table 2 Quenching constants KSV,binding constants Ka and relative thermodynamic parameters of the BRP-α-glucosidase interaction at different temperatures

注:Ra是KSV值的相關(guān)系數(shù);Rb是Ka值的相關(guān)系數(shù)。

BRP與α-葡萄糖苷酶的熱力學參數(shù)可以通過以下公式計算:

式(3)

ΔG=ΔH-TΔT

式(4)

式中:Ka表示結(jié)合常數(shù);T為溫度(298、304、310 K);R為氣體常數(shù)(8.314 J·mol-1·K-1)。

由表2中的數(shù)據(jù)可以看出,BRP與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)較大,表明BRP與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合能力較大,且隨著溫度的升高,結(jié)合常數(shù)略有升高,這可能是因為溫度的升高導致復合物的穩(wěn)定性升高,從而導致結(jié)合常數(shù)變大。此外,在不同溫度下結(jié)合位點數(shù)n值均接近于1,這表明BRP與α-葡萄糖苷酶有一個或一類相對獨立的結(jié)合位點。

通過熱力學參數(shù)焓變ΔH和熵變ΔS的大小可以確定小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用力,根據(jù)公式(3),以1/T為自變量，InKa為應(yīng)變量,擬合曲線,根據(jù)斜率和截距求出焓值和熵值,再根據(jù)公式(4)算出吉布斯自由能,若ΔH>0,ΔS>0表明為疏水相互作用;ΔH<0,ΔS<0為范德華力和氫鍵;ΔH<0,ΔS>0表明為靜電相互作用;若ΔG<0則表明結(jié)合過程是自發(fā)的。由表4可知,ΔH>0,ΔS>0,據(jù)此推測BRP和α-葡萄糖苷酶之間的相互作用主要是疏水相互作用,且ΔG<0,表明結(jié)合過程是由焓和熵驅(qū)動的自發(fā)過程。

3 結(jié)論

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定結(jié)果表明BRP中含有1種酚醛、2種酚酸酰胺、4種酚酸糖苷、6種酚酸、6種酚酸酯和8種黃酮糖苷,這些多酚活性物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性(最高抑制率為39.37%),可能的原因是BRP中含有一定量的游離酚酸,它能與α-葡萄糖苷酶發(fā)生疏水相互作用,對α-葡萄糖苷酶的內(nèi)源熒光具有動態(tài)猝滅作用;而BRP對α-淀粉酶無明顯抑制作用,可能是因為BRP中主要為酚酸和黃酮類的衍生物,且以C-糖苷和O-糖苷的形式存在為主,因此BRP對α-淀粉酶的抑制作用較小。以上結(jié)果表明,BRP主要通過與α-葡萄糖苷酶發(fā)生疏水相互作用,抑制α-葡萄糖苷酶的活性,從而延緩碳水化合物的消化和水解。