解淀粉芽孢桿菌psd基因過表達對胞苷發酵的影響

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(1.寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室,寧夏銀川 750021;2.寧夏大學農學院,寧夏銀川 750021)

胞苷是生物體內核酸的結構組成部分,有重要的調控作用,表現出多方面的生理活性[1]。其用途主要用于生產抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，是基因工程研究的原材料[2]。胞苷的深入研究和廣泛應用使得其需求量與日俱增,傳統的嘧啶核苷生產方法核糖核酸(RNA)水解法已難以滿足市場的需求量。因此研究高效合成胞苷的方法,不斷提高胞苷生產水平以解決我國的胞苷產量問題就顯得尤為重要[3]。

表1 引物序列及其引入的酶切位點Table 1 Primer sequences and their restriction sites

注:引物序列下劃線部分表示各酶切位點。

微生物發酵法生產胞苷具有成本低、周期短、產量高等優勢,因而得到了高度的重視[4]。近年來,通過發酵法提高胞苷產量的研究逐漸增多。發酵法生產胞苷一般有添加前體物發酵法和直接發酵法,前者通過微生物細胞內的5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)在尿嘧啶核糖磷酸轉移酶(pyrR/upp)的催化下直接生成尿苷酸(UMP),經過尿苷二磷酸(UDP)、三磷酸尿苷(UTP)、胞苷三磷酸(CTP)生成胞苷[5-6]。后者利用微生物生成UMP,然后再經UDP、UTP、CTP生成胞苷[7]。增強PRPP合成途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶和PRPP合成酶劑量也能夠有效提高胞苷的產量[8],另外還可以通過微生物遺傳育種技術,選育高產胞苷的發酵菌株[7]。方海田等[9-10]先后研究了基因定點突變法強化胞苷的合成積累，并用Red重組系統敲除法阻斷高絲氨酸途徑,增加了天冬氨酸分流量對胞苷的積累。吳曉嬌等[11]研究結果表明過表達操縱子基因carAB和pyrBI均可促進胞苷的積累。蘇靜等[4]通過敲除枯草芽孢桿菌cdd基因,提高胞苷產量。Asahi等[12]利用化學誘變法研究了胞苷高產菌的菌種選育,表明誘變后篩選得到的突變菌株能夠提高胞苷發酵單位。另外,孫占敏等[13]、張春艷等[14]、盛春雷等[15]、黃艷輝等[16]和吳曉嬌等[17]從胞苷生產菌株的選育和培養基的優化等方面也進行了研究。

研究表明,微生物法生產嘧啶核苷要求菌株具有很強的天然磷酸單酯酶活力[18],而解淀粉芽孢桿菌具備這一特性,另外解淀粉芽孢桿菌全基因組信息清楚,遺傳背景清晰,嘧啶代謝通量大,適合作為胞苷生產的出發菌株[19-20]。

本試驗以解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensBG-09)作為出發菌株,通過過表達與細胞膜通透性相關的基因psd,基因psd編碼的酶磷脂酰絲氨酸脫羧酶[EC:4.1.1.65]與細胞膜磷脂合成密切相關,進而改變細胞膜結構,使胞苷由細胞內滲透到細胞外,顯著提高胞苷產量。同時研究了過表達psd基因對菌體生長、葡萄糖利用和尿苷合成等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌BG-09、質粒pHT43 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室保藏;DH5a化學感受態細胞 寶日醫生物技術(北京)有限公司;pMD19-T載體TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司；細菌基因組DNA小量試劑盒、質粒小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒 寶日醫生物技術(北京)有限公司;Fast Digest AatⅡ、Fast Digest BamHⅠ與DL10,000 DNA Maker Ferments公司;其余常規試劑 均為國產分析純;斜面活化培養基(g/L) 蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,瓊脂10,pH7.0,121 ℃滅菌20 min；LB培養液(g/L) 蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH7.0,121 ℃滅菌20 min;種子培養基(g/L) 葡萄糖5,蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,pH7.0,121 ℃滅菌15 min;搖瓶發酵培養基(g/L) 葡萄糖100,酵母粉10,K2HPO410,KH2PO40.5,FeSO410 mg,MnSO410 mg,MgSO4400 mg,pH7.0,121 ℃滅菌15 min。

752N分光光度計 上海精科實業有限公司;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所;JY92-IINP超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;LC-16島津液相色譜儀 北京島津醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設計與合成 根據解淀粉芽孢桿菌BG-09psd基因全序列(KEGG登錄號T00582),采用Primer Premier 5.0設計引物。根據試驗要求,在psd基因上下游100 bp范圍內設計上下游擴增引物,并分別在上、下游引物中添加AatⅡ和BamHⅠ酶切位點。添加保護堿基后,設計一對引物psd-S,psd-A,用于擴增psd基因上、下游片段(表1)，并委托生工生物工程(上海)有限公司合成。依據兩酶切位點,設計質粒pHT43的鑒定引物,如表2所示。

表2 鑒定引物設計Table 2 Design of primers for identification

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌基因組DNA的提取 采用TaKaRa細菌基因組小量提取試劑盒提取解淀粉芽孢桿菌BG-09基因組DNA,提取后用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,提取的DNA置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3psd基因克隆 以解淀粉芽孢桿菌BG-09基因組DNA為模板,分別加入正、反向引物,PCR擴增psd基因,反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收。PCR反應的體系:Premix Taq 25 μL,模板1 μL,正、向引物各1 μL,dd H2O 22 μL。PCR反應條件:DNA模板經過95 ℃預變性5 min,進入30個循環:先95 ℃變性50 s成單鏈,60 ℃退火30 s使得引物分別與其同源序列相結合,再72 ℃延伸1.5 min形成雙鏈,最后72 ℃再延伸5 min,4 ℃保存。文中其他PCR反應均按照此反應條件和比例進行。

1.2.4 TA克隆載體構建 回收目的DNA片段并連接至pMD19-T載體上,將連接產物轉化至DH5a感受態細胞,在LB平板上培養;挑取陽性克隆菌落進行PCR鑒定,提取質粒經AatⅡ和BamHⅠ 酶切鑒定后得到陽性克隆,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.5 重組載體構建 采用AatⅡ、BamHⅠ對測序正確的陽性克隆質粒與質粒pHT43進行雙酶切,分別回收884和8038 bp的骨架載體片段,按4∶1的比例于16 ℃經T4 DNA連接酶過夜連接,將所得連接產物轉化至DH5a感受態細胞,在含有50 mg/mL氨芐青霉素和氯霉素的LB培養基上培養[21]。從轉化菌落中提取重組載體,重組克隆質粒經菌落PCR鑒定、提取質粒PCR鑒定和雙酶切鑒定后,將陽性轉化子測序,將測序正確的克隆命名為pHT43-psd。

1.2.6 解淀粉芽孢桿菌電轉化感受態細胞的制備及轉化 解淀粉芽孢桿菌BG-09電轉化感受態細胞的制備及轉化[22]。轉化后轉化子的多少通過在涂布相同轉化菌液量的情況下平板上菌落計數確定，轉化子陽性率的鑒定通過菌落PCR鑒定、提取質粒PCR鑒定、雙酶切鑒定和鑒定引物鑒定[23]。驗證成功的菌株即為構建好的工程株,保存菌株,并將菌株命名為B.amyloliquefaciensBG-09-psd。

1.2.7 重組質粒的誘導表達 將經過測序驗證的重組菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd和B.amyloliquefaciensBG-09單菌落分別接種于含終濃度50 mg/L氯霉素、氨芐青霉素的LB和LB培養液試管中,37 ℃、200 r/min培養過夜;以1%接種量接種于含有30 mL LB培養液的500 mL三角瓶中,37 ℃、200 r/min 培養至OD600=0.6～0.8,加入0.5 mmol/L(終濃度)IPTG,再培養4 h后取出離心收集菌體,經超聲破碎后取細胞裂解產物進行SDS-PAGE蛋白電泳分析。同時以B.amyloliquefaciensBG-09和帶有空質粒pHT43的菌株B.amyloliquefaciensBG-09作為對照實驗[11,24]。

1.2.8 工程菌搖瓶發酵試驗 將經過驗證的重組菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd單菌落接入裝有種子培養基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養24 h后,按10%的接種量接入裝有發酵培養基的搖瓶中,37 ℃、200 r/min振蕩培養70 h。同時以出發菌株B.amyloliquefaciensBG-09作為對照試驗[11]。

1.2.9 菌體密度測定 分別取不同發酵時間的發酵液,用蒸餾水稀釋,采用752型分光光度計于600 nm處測其吸光值[25]。

1.2.10 發酵液中殘糖測定 取不同發酵時間的發酵液,稀釋到其中葡萄糖質量濃度0～1 g/L,采用SBA-40E生物傳感分析儀測定[11]。

1.2.11 胞苷產量測定 采用高效液相色譜法(HPLC)測定發酵液中胞苷產量。色譜條件:Agilent C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)為分離柱,V(乙腈)∶V(水)=4∶96為流動相,流動相流速為1 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長270 nm,檢測器為紫外檢測器[26-27]。

1.3 數據處理

文中所有數據結果均以三組平行試驗的平均值±標準差表示,采用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 psd基因上下游擴增及TA克隆載體構建

2.1.1psd基因上下游片段擴增 以解淀粉芽孢桿菌BG-09總DNA為模板,以特異性引物psd-S、psd-A擴增目的片段。如圖1所示,1、2序列擴增產物在880 bp左右有明顯條帶,與目的片段大小一致。如圖2所示,1、2序列切膠回收條帶清晰。

圖2 目的片段PCR切膠回收Fig.2 PCR cutting gel recovery of target fragment注:M:DL10000 DNA Marker;1、2:PCR擴增產物回收。

2.1.2 TA克隆載體鑒定 挑取陽性克隆菌落對重組質粒進行菌落PCR鑒定,如圖3所示,1～24條帶均為陽性菌落擴增產物,其中第19條帶不正確,其它擴增產物大小分布在880 bp左右,與目標條帶大小一致,可初步鑒定為陽性克隆。

圖3 重組質粒T-psd菌落PCR鑒定結果Fig.3 PCR identification results of recombinant plasmid T-psd colony注:M:DL10000 DNA Marker;1～24:陽性菌落擴增產物,其中19條帶不正確。

為進一步驗證重組質粒的正確性,防止PCR擴增造成的假陽性,挑取陽性克隆用AatⅡ、BamHⅠ對提取質粒進行雙酶切鑒定。結果如圖4所示,挑取的陽性克隆經雙酶切后,均獲得長度大約為880和2700 bp的基因和空載體,進一步證實該克隆為包含目的片段的陽性克隆。將TA-psd提質粒進行PCR,結果如圖5所示。其中2、4、5條帶不正確,17、18、19未擴增出條帶,將剩余的1、3、6、9、12號初步鑒定的陽性克隆菌株送去測序,測序結果表明1、9號為陽性克隆菌株,選定1號菌株進行下一步實驗。

圖4 重組質粒T-psd的雙酶切(A)和pHT43雙酶切(B)Fig.4 Double enzymatic digestion of recombinant plasmid T-psd(A)and pHT43 double digestion results(B)注:M:DL10000 DNA Marker;(A)1:重組質粒T-psd的雙酶切;(B)1:pHT43雙酶切。

圖5 TA-psd提取質粒PCR擴增結果Fig.5 TA-psd extraction plasmid PCR amplification results 注:M:DL10000 DNA Marker;1～19:TA-psd提質粒PCR,其中2、4、5條帶不正確。

2.2 重組載體pHT43-psd的鑒定

如圖6和圖7所示,轉化子經菌落PCR和提取質粒PCR鑒定后,在880 bp左右均擴增出明顯條帶,與目標條帶一致;圖8序列3顯示提取的質粒經AatⅡ、BamH 雙酶切后,得到兩條片段長度大約分別為880和8038 bp,與連接長度一致,表明帶有基因psd的重組載體pHT43-psd構建成功,測序鑒定結果也說明序列完全正確。

圖6 轉化子菌落PCR鑒定結果Fig.6 Identification results of PCR of transformant colony注:M:DL10000 DNA Marker;1～24為轉化子菌落PCR,其中13、20是正確條帶。

圖7 轉化子提取質粒PCR擴增結果Fig.7 PCR amplification results of plasmids extracted from the transforman注:M:DL10000 DNA Marker;1～7轉化子提取質粒PCR,5號條帶不正確。

圖8 轉化子雙酶切鑒定結果Fig.8 Identification results of transformants by double enzyme digestion注:M:DL10000 DNA Marker;1～3:轉化子雙酶切,其中3為正確條帶。

2.3 電轉化法轉化B. amyloliquefaciens BG-09

解淀粉芽孢桿菌的自然感受態是在對數生長后期開始形成的,由于不同生長時期的菌體產生感受態的敏感程度不一樣,因而選擇合適的生長時期對于感受態的形成與再生較為關鍵[28]。轉化子菌落形態如圖9所示,與原始菌株B.amyloliquefaciensBG-09相比,在相同的培養時間內經過電轉化構建的菌株形態明顯小于原始菌株B.amyloliquefaciensBG-09,在電轉化過程中瞬時高壓對菌株造成傷害,使菌株數量變少，菌體形態變小。挑取陽性克隆菌落進行菌落PCR鑒定,結果如圖10所示,10號菌落PCR鑒定得到880 bp的條帶,驗證正確;提取質粒PCR、提取質粒雙酶切和引物鑒定分別如圖11、圖12和圖13所示,提取質粒PCR得到大約880 bp的條帶,鑒定引物PCR未擴增出條帶,均證明重組質粒成功導入解淀粉芽孢桿菌BG-09中。

圖9 轉化后B. amyloliquefaciens BG-09-psd菌落形態Fig.9 Morphology of B. amyloliquefaciensBG-09-psd colony after transformation

圖10 菌落PCR鑒定結果Fig.10 Identification results of colony by PCR注:M:DL10000 DNA Marker;1～14菌落PCR,其中10號為正確條帶。

圖11 提取質粒PCR鑒定結果Fig.11 Identification results of extracted plasmid by PCR

圖12 提取質粒雙酶切鑒定結果Fig.12 Identification results of extraction plasmidsby double enzyme digestion

圖13 鑒定引物PCR鑒定結果Fig.13 Identification results of identification primers by PCR

2.4 重組質粒(B. amyloliquefaciens BG-09-psd)的誘導表達

將B.amyloliquefaciensBG-09-psd超聲破碎,收集菌體和上清液,進行SDS-PAGE蛋白電泳,結果如圖14所示,由圖14可知,psd基因在破碎的菌體中有表達。在相對分子量約為32 kDa處有蛋白條帶,表明psd基因在B.amyloliquefaciensBG-09中得到表達。

圖14 psd表達的SDS-PAGE結果(圖中箭頭有改動)Fig.14 SDS-PAGE results of psd expression注:M:Marker(10-180KDa);泳道1:B.amyloliquefaciens BG-09-psd;2:B.amyloliquefaciens BG-09;3:B.amyloliquefaciens BG-09-pHT43。

2.5 重組質粒對菌體生長與耗糖的影響

圖15和圖16分別為菌株發酵生產胞苷的菌株生長及耗糖速度的變化曲線,可以看出,重組質粒對菌體的生長和耗糖都有一定的影響,工程菌B.amyloliquefaciensBG-09和菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd大約在10 h后進入對數生長期,B.amyloliquefaciensBG-09-psd菌株的最大OD600值為5.949,出發菌為5.928,生長水平相當,生長能力沒有受到抑制。B.amyloliquefaciensBG-09-psd在0～50 h OD600值較菌株B.amyloliquefaciensBG-09有所下降,可能與psd基因有關,推測為psd基因改變細胞膜通透性從而導致細胞代謝失衡所致。

圖15 不同菌株的發酵生長曲線Fig.15 Fermentation growth curve of different strains

圖16 不同菌株的耗糖速率曲線Fig.16 Curve of rate of sugar consumption of different strains

在0～50 h菌體密度與耗糖速率成正相關,隨著有害代謝副產物的積累,菌體的生長受到限制,在發酵后期菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd耗糖速率呈下降趨勢。菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd的耗糖速率在60 h時達到最大值2.420 g·L-1·h-1,工程菌B.amyloliquefaciensBG-09在60 h時耗糖速率為1.235 g·L-1·h-1,較B.amyloliquefaciensBG-09-psd低48.97%。在0～60 h葡萄糖的消耗速率增加是由于在此過程中胞苷、尿苷等代謝產物的不斷積累;菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd60 h后葡萄糖消耗量減少是由于菌體生長進入穩定期,產生了抑制性的發酵副產物,抑制了菌體生長,所以葡萄糖的消耗量逐漸減少,也可能是菌體產生的代謝產物之間發生了相關的反應,減少了菌體對葡萄糖的消耗或是產生的代謝產物能代替葡萄糖作為能源物質;發酵過程中,重組菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd葡萄糖消耗速率變化快于B.amyloliquefaciensBG-09,這說明過表達基因psd對菌體的生長和耗糖速率都有一定的影響,使菌體的代謝負擔加重,葡萄糖消耗速率增加,菌體生長較慢且更早地進入對數生長期較晚地進入生長穩定期。

2.6 重組質粒對胞苷積累的影響

將培養過程中發酵液離心取上清,HPLC法測定發酵液中胞苷的積累量,以解淀粉芽孢桿菌BG-09原始菌株作為對照，分別測定了不同菌株的尿苷和胞苷產量，探究發酵0～70 h過程中尿苷產量及其對胞苷產量的影響。由圖17、圖18可知,菌株B.amyloliquefaciensBG-09和B.amyloliquefaciensBG-09-psd的20～70 h發酵液中均含有尿苷和胞苷。發酵過程中,菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd70 h可以積累(0.552±0.02) g/L尿苷,比B.amyloliquefaciensBG-09菌株尿苷產量(0.578±0.01) g增加了6.56%。在發酵過程中尿苷大體呈現先減少后增加的趨勢,由于發酵初期營養物質豐富尿苷迅速合成,之后絕大部分的尿苷分解產生尿嘧啶所致,而菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd變化較明顯,原因可能是psd基因過表達影響了細胞膜的通透性。

圖17 不同菌株的尿苷產量Fig.17 Uridine yield of different strains

發酵過程中,菌株B.amyloliquefaciensBG-09 70 h可以積累(1.038±0.03) g/L胞苷,B.amyloliquefaciensBG-09-psd積累(1.199±0.02) g/L,比出發菌B.amyloliquefaciensBG-09產量提高了15.51%。重組菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd發酵產物明顯高于菌株B.amyloliquefaciensBG-09,由此說明過表達基因psd能夠增強嘧啶代謝途徑,使胞苷的積累量有所提高。在發酵前60 h內，過表達psd基因也能夠使尿苷向胞苷合成的方向移動，增加胞苷累積量。

圖18 不同菌株的胞苷產量Fig.18 Cytidine yield of different strains

3 結論

本文通過過表達解淀粉芽孢桿菌BG-09有關細胞膜滲透性基因psd,分析對胞苷產量的影響。結果表明,過表達基因psd對菌體的生長有一定的影響,使菌體更早地進入對數生長期、較晚地進入生長穩定期。在發酵70 h可以積累(1.199±0.02) g/L胞苷,比出發菌B.amyloliquefaciensBG-09產量提高了15.51%。原始菌株B.amyloliquefaciensBG-09 70 h可以積累(0.518±0.01) g/L尿苷,重組菌株B.amyloliquefaciensBG-09-psd積累(0.552±0.02) g/L,比出發菌B.amyloliquefaciensBG-09產量增加了6.56%。過表達基因psd可以有效改變細胞膜滲透性,促進胞苷的分泌,從而使胞苷產量提高。為了顯著提高胞苷的產量,下一步研究的重點將是通過基因工程技術把胞苷合成途徑中影響細胞膜滲透性的相關基因進行串聯表達,或從優化培養基和降低副產物的積累等多方面提高胞苷產量。