西蘭花莖葉蛋白酶解條件優化及其降血脂活性

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(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021;2.集美大學水產學院,福建廈門 361021)

西蘭花(Brassicaoleracea)又名青花菜,為十字花科蕓薹屬植物,營養豐富,具有很高的食用價值[1]。我國西蘭花產量居世界前列,目前已實現國內周年生產,各地的生產季節相互交叉[2],但除可食用的花球部分,產生大量西蘭花莖葉等副產物,除少部分作為飼料外,大部分在田里腐敗,引起空氣污染及水體富營養化等環境問題[3]。

研究表明,西蘭花富含蛋白質、維生素及礦物質等營養成分,以及膳食纖維、類黃酮和蘿卜硫素等功能成分,具有抗氧化[4]、抗腫瘤[5]、增強免疫力[6]等活性,經常食用可降低某些癌癥、心血管疾病和糖尿病的發病率[7-9]。目前,關于西蘭花營養成分的研究較多,Thejass等[10]報道了西蘭花中蘿卜硫素增強小鼠免疫活性,Reis等[11]分析了西蘭花中類胡蘿卜素、類黃酮、多酚等化合物的抗氧化活性,Mandimika等[12]的研究表明西蘭花膳食纖維能夠降低大鼠血脂。在西蘭花莖葉常規營養成分中,蛋白含量占干物質20%以上[13],是極好的植物蛋白資源,有廣闊的開發利用前景。

我國城市居民疾病死亡率最高的是心腦血管疾病[14],高血脂是心腦血管疾病的主要影響因素。膳食中的功能活性物質對高血脂疾病有良好的預防作用,尤其是植物蛋白源類物質[15],文獻相繼報道大豆[16-17]、大米[18]、大蒜[19]等植物蛋白具有降血脂的功能。本文用胰蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白,通過膜分離和冷凍干燥,得到西蘭花莖葉蛋白肽,并對其降小鼠血脂活性進行研究,以期為西蘭花莖葉蛋白開發利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花莖葉蛋白漿 浙江臺州天萊生物科技有限公司,西蘭花莖葉蛋白漿經真空冷凍干燥后,儲存在干燥的環境中待用(干物質蛋白含量46.34%);胰蛋白酶(酶活為75623 U/g 源葉生物科技有限公司;細胞色素C、胰島素、桿菌肽、氧化型谷胱甘肽、Gly-Gly-Gly(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸) 美國Sigma-Aldrich公司;小鼠普通飼料 北京華阜康公司;小鼠高脂飼料 自行配制[20-21](豬油15%、蔗糖20%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、基礎飼料63.6%);甘油三酯(TC)檢測試劑盒、總膽固醇(TG)檢測試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測試盒、谷丙轉氨酶(ALT)檢測試劑盒、谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;SPF級KM種雄性小鼠 許可證號:SCXK(京)2014-0004 北京華阜康公司。

JDC-0.2真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;CeraMem0100陶瓷膜小型設備、RNF0460多功能卷式膜小型設備 廈門福美科技有限公司;ULTMATE3000高效液相色譜儀 美國賽默飛公司;3K30冷凍高速離心機 德國Sigma公司;邁瑞BS-240vet全自動生化分析儀 邁瑞醫療國際有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 西蘭花莖葉蛋白酶解條件的優化

1.2.1.1 西蘭花莖葉蛋白酶解工藝流程 西蘭花莖葉蛋白漿凍干粉末→加入適量的水→調節溶液pH至酶最適pH→加入適量的蛋白酶→在酶最適溫度下進行酶解→95 ℃滅酶20 min→制備西蘭花蛋白肽

1.2.1.2 響應面法優化酶解條件 在單因素實驗基礎上,固定胰蛋白酶酶解時間為3 h,以水解度為響應值,分析pH、酶解溫度、加酶量和底物濃度(固形物濃度)對胰蛋白酶水解西蘭花莖葉蛋白效果的影響建立四因素三水平的Box-Behnken中心組合實驗。其響應面因素水平表如表1所示:

表1 響應面分析因素及水平表Table 1 Factors and level tables of response surface analysis

1.2.1.3 蛋白水解度的測定 用甲醛滴定法[22]測定水解液的氨基氮含量,凱氏定氮法[23]測定樣品中蛋白質含量,通過式(1)計算水解度。

水解度DH(%)=C×(V1-V0)×0.014×m/(5×M)×100

式(1)

式中:C:NaOH濃度(mol/L),V1:樣品在加入甲醛后消耗NaOH標準溶液體積(mL),V0:空白在加入甲醛后消耗NaOH標準溶液體積(mL),m:酶解液氨基氮質量(mg),M:樣品總氮質量(mg)。

1.2.2 HPLC測定西蘭花莖葉蛋白酶解產物蛋白肽分子量分布 參考國標GB/T 22729-2008。采用TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm)凝膠色譜柱。流動相:乙腈∶超純水∶TFA=45∶55∶0.1 (V∶V),流速:0.5 mL/min,檢測波長:220 nm,柱溫:30 ℃。

校正曲線用的標準品:細胞色素C(MW12384 Da)、胰島素(MW 5777.54 Da)、桿菌肽(MW1422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(MW612.64 Da)、Gly-Gly-Gly(MW189.17 Da)。

1.2.3 西蘭花莖葉蛋白肽酶解產物的制備 西蘭花莖葉蛋白漿→胰蛋白酶水解(優化后的條件)→200 nm孔徑陶瓷濾膜(進膜壓力3 bar,循環流量80 LPM,25 ℃),取透過液→200 Da孔徑卷式膜(進膜壓力25 bar,循環流量25 LPM,25 ℃),取截留液→冷凍干燥→西蘭花莖葉蛋白肽

1.2.4 小鼠降血脂活性的研究

1.2.4.1 實驗動物分組及給藥 參考禇斌杰[24]方法稍作修改。KM種雄性小鼠進行適應性飼養一周,將小鼠分為10只∕組,共6組,分別為空白對照組、陽性對照組(辛伐他汀)、模型對照組和西蘭花莖葉蛋白酶解產物低、中、高劑量組,空白組小鼠喂基礎飼料,其他組小鼠喂高脂飼料。每日定時灌胃體積為10 mL/(kg·BW),低、中、高灌胃劑量分別為300、600、1200 mg/(kg·d),陽性對照劑量為8 mg/(kg·d),另外兩組灌胃等體積雙蒸水。連續灌胃4周,期間每周稱量小鼠體重并按實際體重調整灌胃體積。末次灌胃后,禁食過夜,次日取血。

1.2.4.2 血脂水平測定 測定項目:血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)。

各項指標的測定按照南京建成生物工程研究所的相應測試盒的說明書進行。

1.2.4.3 AI指數的計算 動脈硬化指數(arteriosclerosis index,AI)根據式(2)計算[25]:

動脈硬化指數(AI)=(TC-HDL-C)/HDL-C

式(2)

式中:TC:根據測試盒用全自動生化分析儀測出的總膽固醇含量(mmol/L);HDL-C:根據測試盒用全自動生化分析儀測出的高密度脂蛋白膽固醇含量(mmol/L)。

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 西蘭花莖葉蛋白胰蛋白酶水解條件的優化

在單因素實驗基礎上,以水解度為響應值,選擇pH、酶解溫度、加酶量和底物濃度,建立四因素三水平的響應面試驗。實驗設計及結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiment

運用Design-Expert.8.0.6.1實驗設計軟件對實驗結果進行多元擬合分析,得到胰蛋白酶對pH(A)、溫度(B)、底物濃度(C)和加酶量(D)的二次多元回歸方程:Y=19.34+0.62A+1.22B+4.39C+0.69D+0.050AB-1.96AC+1.25AD-1.06BC+0.14BD+0.035CD-1.16A2-0.81B2-0.72C2-0.42D2,R2=0.9885。根據實驗軟件所得實驗結果可知,模型具有較高的F值和較低的P值(P<0.01),說明該模型具有較高的相關性,且失擬項為0.0789,不顯著,表明所建立的回歸模型能夠應用于理論預測[26]?；貧w方程的各項方差分析表明,A、B、C、D、AC、AD、BC、A2、B2、C2對水解度有極顯著的影響(P<0.01),各因素對胰蛋白酶水解西蘭花莖葉蛋白的影響主次順序為:底物濃度(C)>溫度(B)>加酶量(D)>pH(A)。

圖1采用Design-Expert 8.06軟件作圖,當pH、溫度、底物濃度、加酶量任意兩個因素取零水平時,剩余的兩個因素對水解度的影響，由響應面陡峭程度及等高線可知，pH與底物濃度(AC)、pH與加酶量(AD)、溫度與底物濃度(BC)的交互作用影響顯著。由圖(a)可知,當pH不變時,隨著底物濃度的升高,水解度逐漸升高,上升趨勢較明顯;而底物濃度不變時,隨著pH的升高,水解度先升高后下降,趨勢較緩慢,說明與pH相比,底物濃度為主要影響因素。由圖(b)可知,當加酶量不變時,隨著pH的增大,水解度表現出先緩慢上升后逐漸下降的趨勢,趨勢較陡;當pH不變時,隨著加酶量的增加,水解度逐漸上升,上升趨勢較明顯,表明與pH相比,加酶量為主要影響因素。由圖(c)可知,當溫度一定時,水解度隨著底物濃度的增加逐漸增大,有較明顯的趨勢;當底物濃度一定時,隨著溫度的升高,水解逐漸增大,但趨勢較緩慢,因此相對于溫度,底物濃度為主要影響因素。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

圖1 因素間相互作用的響應面圖Fig.1 Response surface diagram of the interaction between factors

經過Design Expert 8.0.6.1軟件對實驗數據的分析優化后得到胰蛋白酶對西蘭花莖葉蛋白酶解的最優條件為pH7.5、酶解溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、底物濃度4.0%,此條件下胰蛋白酶實際水解度為22.37%±0.46%,與理論水解度23.40%基本一致。

2.2 西蘭花莖葉蛋白酶解物中蛋白肽分子量分布

本實驗以細胞色素C(MW12384 Da)、胰島素(MW5777.54 Da)、桿菌肽(MW1422.69 Da)、氧化型谷胱甘肽(MW612.64 Da)、Gly-Gly-Gly(MW189.17 Da)為標準品,通過標準品的洗脫時間和相對分子質量來測定酶解產物的分子量分布。其中細胞色素C的洗脫時間為11.90 min,胰島素為14.13 min,桿菌肽為15.86 min,氧化型谷胱甘肽為19.01 min,Gly-Gly-Gly為19.85 min。西蘭花莖葉蛋白酶解產物分子量分布如圖2所示,以標準品的洗脫體積為橫坐標,相對分子質量的對數值為縱坐標作圖,如圖3所示。Log(MW)與X(洗脫體積)成線性關系,對應的線性關系方程為Log(MW)=-0.4313X+6.6974,決定系數R2=0.9602,根據線性關系方程,發現西蘭花莖葉蛋白酶解產物分子量主要集中在1000～3000 Da,占總數的64.35%。

圖2 西蘭花莖葉蛋白酶解產物分子量分布圖Fig.2 Molecular weight distribution of proteolytic products of broccoli stems and leaves

圖3 標準品的相對分子量對數與其洗脫體積之間的關系Fig.3 Relationship between the relative molecular weight of the standard and its elution volume

2.3 西蘭花莖葉蛋白肽的降血脂活性

高脂血癥可引起動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗塞和腦卒中等多種嚴重危害人體健康的疾病[27]。有研究報道了膳食蛋白在調節膽固醇代謝中有重要作用[28-30],尤其是大豆蛋白[31]、大米蛋白[32]等植物性蛋白作用明顯,而大豆蛋白的酶解物表現出比未消化的蛋白質具有更高的降膽固醇活性[33],蛋白酶解產物可降低TC、TG、LDL-C含量和增加HDL-C含量[34-36]。

由圖4～圖7可知,本研究發現,西蘭花莖葉蛋白肽的劑量與降低小鼠血清TC、TG、LDL-C含量之間呈現良好的量效關系,在300 mg/(kg·d)的灌胃劑量下,西蘭花莖葉蛋白肽表現出一定的降血脂活性,在600、1200 mg/(kg·d)的灌胃條件下,TC、TG、LDL-C 含量與模型組有極顯著差異(P<0.01),強于黑豆肽1000 mg/(kg·d)的有效灌胃劑量[37]。于TC、TG、LDL-C、HDL-C含量方面,模型組與空白組之間有極顯著差異(P<0.01),與模型組相比,陽性對照組和低、中、高劑量組TC含量均有極顯著差異(P<0.01),TC含量極顯著降低(P<0.01);陽性對照組和中、高劑量組TG和LDL-C含量之間也有極顯著差異(P<0.01),低劑量組TG和LDL-C含量與模型組存在顯著差異(P<0.05),它們的TG和LDL-C含量均明顯降低。由圖7可知,陽性對照和低、中劑量組與模型組相比在HDL-C含量上有極顯著差異(P<0.01),但高劑量組與模型組差異不顯著(P>0.05),可能是因為高濃度樣品使小鼠產生抗藥性[38]。

圖4 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠TC含量的影響Fig.4 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on TC content in mice注:與空白組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。圖5～圖10同。

圖5 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠TG含量的影響Fig.5 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on TG content in mice

圖6 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠LDL-C含量的影響Fig.6 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on LDL-C content in mice

圖7 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠HDL-C含量的影響Fig.7 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on HDL-C content in mice

動脈硬化指數(AI)是一個衡量動脈硬化程度的指標,AI越小，表明患動脈粥樣硬化的可能性越小,它在預測冠心病的發生、發展和嚴重程度方面更優于non-HDL-C和LDL-C[39]。由圖8可知,模型組與空白組有極顯著差異(P<0.01),模型組AI指數明顯上升。陽性對照組和低、中、高劑量組與模型組相比均有極顯著差異(P<0.01),從低劑量到高劑量的AI指數呈現先下降后上升的趨勢,表明灌胃劑量為600 mg/(kg·d)最利于小鼠AI指數的降低，其AI指數最為接近陽性對照組,但還是明顯高于空白組,表明在中劑量時能有效降低AI,但不能恢復至正常水平,這與李漢臣等[40]的研究結果一致。

圖8 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠AI指數的影響Fig.8 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on AI index in mice

AST和ALT主要存在于肝臟的肝細胞內,當肝臟受損時,轉氨酶會釋放到血液中去,所以血液檢測中轉氨酶值會偏高[41]。ALT和AST是用來衡量肝臟功能的指標。由圖9和圖10可知,模型組與空白組之間有極顯著差異(P<0.01),模型組的ALT和AST含量明顯升高。陽性對照組和低、中、高劑量組與模型對照組相比在ALT含量上均有極顯著差異(P<0.01),高劑量組降低ALT含量效果最為明顯。在AST含量方面,低劑量組與模型組之間無顯著差異;中、高劑量組與模型組之間有極顯著差異(P<0.01),明顯強于陽性對照組,表明西蘭花莖葉蛋白肽在較高濃度下具有較好的降低AST含量的效果。高血脂易引起脂肪肝,脂肪肝常表現出AST異常,AST明顯增加意味著可能有嚴重的肝細胞實質損害[42]。西蘭花莖葉蛋白肽在低劑量時,小鼠體內AST含量與模型組之間無顯著差異,在高劑量時血液中 AST和ALT含量降低明顯,基本和空白組一致,表明西蘭花莖葉蛋白肽能夠在一定程度上降低由高血脂引起的肝細胞損傷。

圖9 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠ALT的影響Fig.9 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on ALT in mice

圖10 西蘭花莖葉蛋白肽對小鼠AST的影響Fig.10 Effect of broccoli stem and leaf protein peptide on AST in mice

3 結論

本實驗以水解度為指標,在單因素的基礎上通過 Box-Behnken 實驗和回歸分析,得出胰蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白的最佳工藝參數為:pH7.5、酶解溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、底物濃度4.0%,此條件下胰蛋白酶平均水解度為22.37%±0.46%。對西蘭花莖葉蛋白肽的降血脂活性進行研究發現,西蘭花莖葉蛋白肽的低、中、高劑量組均有助于改善高血脂癥小鼠的血脂水平,且呈現劑量性依賴,并有助于降低高脂膳食小鼠的AI指數和血液 AST和ALT含量,表現出預防動脈粥樣硬化和脂肪肝活性,為西蘭花莖葉蛋白肽降血脂功能食品開發提供研究基礎。