酶解法提取銅藻中海藻酸鈉的工藝優化及物料分析

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(1.山東省海洋生物研究院,山東青島 266104;2.山東省大型海藻資源保護與應用工程技術研究中心,山東青島 266104)

銅藻(Sargassumhorneri)俗稱“丁香屋”,屬于褐藻門(Phaeophyta)褐藻綱(Phaeophyceae)墨角藻目(Fulcales)馬尾藻科(Sargassaceae)馬尾藻屬(Saragassum)[1]。銅藻為北太平洋西部特有的暖溫性海藻,在我國主要分布于遼寧、浙江、福建和廣東等沿海地區[2]。銅藻具有較高的生態價值,是構成潮下帶海藻場的重要種類之一,可以為海洋生物如魚類、貝類等提供繁育場所[3-5]。現階段銅藻研究的熱點主要集中在資源調查及其形態學、生活史、人工增殖和繁殖等方面,在開發利用方面的研究尚處于初級階段[6-8],因此利用率較低,銅藻含有豐富的海藻酸,含量可達22.1%,接近海帶中海藻酸鈉的含量(24.5%)[9],可以作為藻膠工業的原料。

海藻酸是細胞壁的主要填充物質,市場上多以鈉鹽出售,即海藻酸鈉(sodium alginate,AGS)[10-11],廣泛應用于食品、紡織、橡膠、醫藥等領域[12]。長期以來,海帶(Saccharinajaponica)都是我國褐藻膠工業的主要原料[13],但隨著海帶價格的不斷上漲,褐藻膠加工逐漸轉向巨藻(Macrocystispyrifera)、泡葉藻(Ascophyllumnodosum)等國際原料藻[14]。目前對銅藻提取海藻酸鈉的報道,僅有王作蕓等[15]分離純化了銅藻的海藻酸鈉、褐藻淀粉等成分,但對最適的分離和純化條件未進行深入探討;王其東等[16]應用銅藻海藻酸鈉作為魚糜保水劑進行魚糜產品的開發,未涉及提取工藝。

海藻酸鈉的傳統生產工藝為有機體系浸泡后再消化,耗能耗水量大,溶劑排放還會造成環境危害;以往的酶解法多采用纖維素酶作為單一酶進行酶解[17-20],成本較高,且效果不佳;復合酶法僅見田洪蕓等和李德茂等[21-22]的研究,且采用的是分步法進行酶解。本研究以銅藻為原料,利用復合酶解法同步加入復合酶,簡化了操作流程,優化了提取工藝,通過提取率、細胞壁結構變化及耗費物料對比了傳統工藝和復合酶解法的差異,為銅藻資源的開發利用提供新方向,也為進一步開發酶解法提取海藻酸鈉奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅藻 山東榮成俚島;果膠酶((6×104U/g)、木瓜蛋白酶(80×104U/g)、纖維素酶(2×104U/g) 龐博生物工程有限公司;水解酶(20×104U/g)、纖維素酶Ⅱ(20×104U/g) 諾維信酶制劑公司;果膠酶Ⅱ(6×104U/g)、酸性蛋白酶(10×104U/g)、纖維素酶Ⅲ(20×104U/g) 隆科特酶制劑有限公司;無水碳酸鈉、鹽酸、無水乙醇、無水氯化鈣、醋酸鈣、氫氧化鈉 分析純,國藥集團。

FW80-1粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;PHS-3E pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 河南省予華儀器有限公司;YLD-6000電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;S-340N型掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海藻的采集與處理 2018年5月,選擇生長旺盛、藻體完整的銅藻成體進行采集。采集的銅藻用過濾海水洗刷干凈,60 ℃烘干,粉碎,過40目篩,裝入自封袋,置于冰箱中-20 ℃保存備用。

1.2.2 酶解法提取海藻酸鈉 按照酶解、消化、鈣析、酸化和醇沉的工藝進行,具體如下:銅藻粉按料液比1∶20 (mg/L)加入水和一定比例的酶,調節pH、溫度,進行酶解;加入溶液質量2%的碳酸鈉,60 ℃保持2.5 h進行堿消化;調pH至6～7,加入10%氯化鈣溶液,靜置0.5 h后過濾收集沉淀;沉淀加入6 mol/L的鹽酸酸化兩次,每次0.5 h,形成海藻酸;過濾收集沉淀,加入碳酸鈉中和,形成海藻酸鈉;用等體積乙醇進行脫水,收集沉淀物放入55 ℃烘箱中烘干,稱量并檢測。

1.2.3 傳統工藝提取海藻酸鈉 銅藻粉以0.5%的甲醛固色4 h,之后沖洗干凈,按照1.2.2酶解法中的消化、鈣析、酸化和醇沉工藝流程進行試驗[23]。

1.2.4 不同酶制劑酶解效果的比較 為篩選海藻酸鈉得率較高的酶,分別加入果膠酶Ⅰ(A)、木瓜蛋白酶(B)、纖維素酶Ⅱ(C)、水解酶(D)、纖維素酶Ⅱ(E)、果膠酶Ⅱ(F)、酸性蛋白酶(G)和纖維素酶Ⅲ(H),按照各自的最佳酶解條件(見表1),料液比1∶20,酶解2 h,以海藻酸鈉得率為指標,考察不同酶制劑對得率的影響。

表1 不同酶的最佳水解條件Table 1 Optimal hydrolysis conditions of different enzymes

1.2.5 單因素實驗 以海藻酸鈉得率為指標,分別加入水解酶和纖維素酶Ⅱ,考察酶添加量、酶解溫度、pH和時間各因素對提取率的影響。

1.2.5.1 酶添加量 分別加入銅藻干重0.6%、0.8%、1%、4%的水解酶,0.6%、0.8%、1%、4%的纖維素酶,調節pH至5.0,55 ℃酶解2 h,制備海藻酸鈉,計算得率。

1.2.5.2 酶解時間 固定酶添加量,依次為水解酶0.6%,纖維素酶Ⅱ0.6%,調節pH至4.0,55 ℃酶解30、60、90、120、150 min,制備海藻酸鈉,計算得率。

1.2.5.3 酶解溫度 固定酶添加量,依次為水解酶0.6%,纖維素酶Ⅱ0.6%,調節pH至5.0,分別置于45、50、55、60 ℃酶解2 h,制備海藻酸鈉,計算得率。

1.2.5.4 pH 固定酶添加量,依次為水解酶0.6%,纖維素酶Ⅱ0.6%,調節pH依次為4.0、4.5、5、5.5、6.0,55 ℃酶解2 h,制備海藻酸鈉,計算得率。

以上實驗各重復3次。

1.2.6 海藻酸鈉酶解條件的正交實驗 根據單因素優化實驗結果,選用水解酶:纖維素酶Ⅱ的比例(A)、時間(B)、溫度(C)、pH(D)4個因素做L9(43)正交表進行條件優化,最終確定酶解法的最佳工藝條件。每個試驗重復3次。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 海藻酸鈉得率的測定 準確稱量海藻酸鈉提取樣品1.0 g,加入2 mol/L鹽酸30 mL,充分攪拌后靜置過夜,用蒸餾水沖洗至無氯離子為止。加入0.1 mol/L醋酸鈣30 mL,充分攪拌,反應2 h,酚酞做指示劑,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定[24]。

海藻酸鈉得率=(C×V×0.2160)×100%/m

式中:C為氫氧化鈉的摩爾濃度,mol/L;V為滴定消耗的氫氧化鈉體積,mL;0.2160表示0.1 mol/L氫氧化鈉標準溶液1.0 mL相當于0.2160 g海藻酸鈉;m為樣品質量，g。

1.2.8 電鏡掃描樣品的制備 分別將經復合酶提取法和有機試劑浸提處理后的銅藻渣用戊二醛溶液浸泡固定2 h,之后將樣本置于0.1 mol/L磷酸緩沖溶液(pH7.4)中20 min,用30%～100%的酒精梯度洗脫,醋酸異戊酯置換,臨界點二氧化碳干燥,離子濺射噴金20 s[25],置于環境掃描電鏡下觀察放大1500倍和3000倍時藻渣形態[26]。

1.3 數據處理與分析

試驗數據用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析,采用Origin Pro8軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酶制劑的確定

選定8種酶,分別測得海藻酸鈉的得率,如圖1所示。結果表明,各種酶對銅藻均具有一定的酶解效果,海藻酸鈉的得率依次為水解酶(D)>纖維素酶Ⅱ(E)>酸性蛋白酶(G)>木瓜蛋白酶(B)>纖維素酶Ⅰ(C)>纖維素酶Ⅲ(H)>果膠酶Ⅰ(A)>果膠酶Ⅱ(F),其中水解酶(D)和纖維素酶Ⅱ(E)效果較好,海藻酸鈉得率分別為15.92%和13.26%。海藻酸主要存在于細胞壁中,而細胞壁及細胞壁間質主要成分為果膠和纖維素[27],同時還存在大量的蛋白質[28]。纖維素酶和水解酶(果膠酶和木聚糖酶的復合物)均能加速細胞組織的崩解,提高酶解效果,因此選擇水解酶和纖維素酶Ⅱ為考察對象,進行后續研究。

圖1 不同酶提取海藻酸鈉的效果Fig.1 Effect of different enzymes on the yield rate of AGS

2.2 單因素實驗

2.2.1 酶添加量對得率的影響 由圖2可知,海藻酸鈉的提取率隨著水解酶添加量的增加先升高后降低,在酶添加量為0.8%時,提取率最高;隨著纖維素酶Ⅱ添加量的增加,海藻酸鈉的提取率持續增加,當酶添加量達到1%后,提取率提高減緩。酶用量過低會導致反應物不能完全反應,酶用量過高則會抑制酶促反應的發生,本試驗條件下兩種酶的適宜添加量分別為0.8%和1%。綜合考慮,選擇水解酶∶纖維素酶Ⅱ的添加比例分別為0.8%∶1%、1%∶1%和1%∶0.8%進行正交試驗。

圖2 酶添加量對海藻酸鈉得率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentrations on the yield rate of AGS

2.2.2 酶解時間對得率的影響 由圖3可知,海藻酸鈉的得率隨著時間的延長呈上升趨勢,纖維素酶Ⅱ和水解酶在酶解時間達到120 min后,得率增長幅度趨于平緩。時間太短,酶活力沒有被充分利用;而時間長會導致部分酶失去活性,考慮到經濟效益和提取率,酶解時間選擇90 min。正交實驗選擇60、90和120 min三個水平。

圖3 酶解時間對海藻酸鈉得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on the yield rate of AGS

2.2.3 酶解溫度對得率的影響 由圖4可知,纖維素酶Ⅱ和水解酶的得率隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢,在55 ℃時,得率最高。酶解溫度過低,酶活力低;酶解溫度過高,會導致酶失去活性或喪失活性。綜合考慮,選擇50、55和60 ℃三個水平進行正交試驗。

圖4 酶解溫度對海藻酸鈉得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on the yield rate of AGS

2.2.4 pH對得率的影響 由圖5可知,水解酶和纖維素酶Ⅱ的得率分別在pH為4.5和5時達到最高。pH影響酶的穩定性,改變pH會影響酶分子的空間構象、基團解離狀況、酶分子及底物的結合狀態等,從而影響酶解反應[29]。從酶作用效果等方面綜合考慮,選擇小范圍變化的pH4.0、4.5和5.0作為三個水平進行正交試驗。

圖5 pH對海藻酸鈉得率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield rate of AGS

2.3 正交試驗結果

表3 正交實驗L9(43)結果Table 3 Results of orthogonal experiment L9(43)

從表3可以得出,影響得率的四個因素由大到小為:C>A>D>B,即溫度對得率影響最大,其次是加酶比例、pH、酶解時間,較優水平組合為A1B2C2D3。根據上述優化結果,在水解酶和纖維素酶Ⅱ比例為0.8%∶1%,pH為5,55 ℃酶解90 min的優化條件下,重復實驗5次,測得其平均得率為24.51%±0.54%。傳統甲醛法制備海藻酸鈉的得率為16.71%±0.66%,復合酶法比傳統方法得率提高了46.7%。另外,復合酶法要優于單酶酶解,得率分別比單一水解酶和纖維素酶提高了40.05%和84.84%。由此可見,裂解植物細胞壁需要多種酶類的共同作用。本研究采用復合酶同步加入的方法,與分步加入法相比,簡化了反復調節溫度和pH的繁瑣步驟。

2.4 電鏡觀察

與傳統工藝相比,酶解法能明顯提高海藻酸鈉的得率,為了進一步解釋這一結果,通過掃描電鏡對兩種方法處理后的藻渣進行觀察,結果如圖6所示。

圖6 不同工藝處理后的藻渣微觀結構Fig.6 The internal structure of algae residue after different treatments

經甲醛處理的銅藻渣細胞壁結構較為完整,形態變化不大,而經酶解處理后的銅藻渣基本已觀察不到完整的細胞壁結構,表面呈現出明顯的孔洞和破碎,細胞被破壞得較為嚴重。通過二者細胞表觀結構的比較,驗證了復合酶提取法有利于破壞海藻細胞的表觀結構,從而促進了酶解作用,有利于多糖的溶出,提高了海藻酸鈉的提取率。

2.5 主要物料差異分析

由表4可知,以處理銅藻量10 kg為例進行計算:傳統法和酶解法后期的消化、鈣析、酸化、中和等工藝步驟相同,物料消耗相同,主要區別在前處理工藝。

表4 物料差異表Table 4 Table of matrial difference

其中,傳統工藝中原料加水量為250 kg(料液比為1∶25 (g/mL)),總用水量為280 kg,甲醛用量為1.25 kg(濃度一般為0.5%);酶解工藝中原料加水量為200 kg(料液比1∶20 (g/mL)),總用水量為230 kg,檸檬酸用量為0.21 kg,酶用量為0.18 kg。其他物料用量兩種方法基本相同。

兩種方法的主要物料差異:傳統法甲醛用量1.25 kg,用水量比酶解法多50 kg;酶解法酶用量0.18 kg,檸檬酸鈉用量0.21 kg,海藻酸鈉產量比傳統法多0.78 kg。

兩種方法的主要物料成本差異:傳統法中甲醛1.25 kg×28元/kg=35元;酶解法中檸檬酸0.21 kg×40元/kg=8.4元,酶制劑0.18 kg×300元/kg=54元。兩種方法得到的產品海藻酸鈉價格差為(2.45-1.67) kg×300元/kg=234元。酶解法比傳統法多得到234-(54+8.4-35)=206.6元,多消耗的成本僅相當于新增產出的(54+8.4-35)/206.6=13.26%。同時酶解法減少了稀釋用水量和工業廢水的排放量,綜上可以看出酶解法要優于傳統法。

3 結論

酶解法有效破壞了銅藻細胞壁的結構,促進了多糖的溶出,提高了海藻酸鈉的得率。通過正交試驗,得到最佳提取工藝為:水解酶添加量0.8%、纖維素酶Ⅱ添加量1%,pH為5的條件下,55 ℃酶解120 min,通過消化、脫色、鈣析、酸化和醇沉等工藝制備海藻酸鈉,得率可達到24.51%±0.54%,較傳統工藝提高了46.7%,為銅藻的高值化加工提供有效的技術途徑。要實現海藻酸鈉的酶解制備的大規模工業生產,還需要進一步研發高活性、高純度的酶制劑,以降低酶用量,提高酶解效能,從而達到降低成本,提高生產能力的目的。