高效液相色譜-熒光檢測法測定食品中維生素K2的含量

(深圳市計量質量檢測研究院,國家營養食品質量監督檢驗中心(廣東),廣東深圳 518131)

天然維生素K(Vitamin K,VK)是一類基本結構為2-甲基-1,4-萘醌的脂溶性維生素,參與人體骨代謝和細胞生長,是肝內合成凝血酶原的必需物質,具有止血功能,當體內缺乏時可造成凝血障礙[1]。根據其側鏈結構的不同,天然維生素K可分為維生素K1(Vitamin K1,VK1)、維生素K2(Vitamin K2,VK2)兩類。維生素K1亦稱葉綠醌,在母環C-3位置上有一個植烷取代基,主要存在于綠色植物中。維生素K2亦稱甲萘醌,是系列化合物,根據母環C-3位置上異戊二烯單元個數的不同,分為14種,以MK-n表示(圖1),其中n指異戊二烯單元的個數[2],維生素K2主要由微生物代謝產生,少量存在于肉類、動物內臟、雞蛋、乳制品、發酵性食品中,在納豆中較豐富[3]。維生素K2是唯一具有生物活性的維生素K,其中以四烯甲萘醌(Menatetrenone 4,MK-4)、七烯甲萘醌(Menatetrenone 7,MK-7)最具代表性[4]。然而目前國內主要以維生素K1作為添加劑添加到食品中,以補充人體內維生素K的不足,維生素K2發展仍屬起步階段。但維生素K1需在肝臟內轉化為維生素K2才能被人體吸收利用,其在體內的生物利用率僅為維生素K2的二分之一[5]。

隨著其藥用價值的突顯,維生素K2已然成為國際上新一代預防和治療骨質疏松的保健食品[6]。1995年,日本首次將維生素K2作為治療骨質疏松藥物應用[2]。2008年,美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)將納豆枯草芽孢桿菌發酵的MK-7列入安全類食品添加劑[7]。2009年,歐盟(European Union,EU)通過2009/345/EC決議,批準以納豆枯草芽孢桿菌發酵的維生素K2作為一種新型食品配料投放市場[8]。我國臺灣地區也將維生素K2作為第八類“營養添加劑”添加到食品中[7]。2016年,國家衛生和計劃生育委員會在《關于海藻酸鈣等食品添加劑新品種的公告(2016年第8號)》中將維生素K2(發酵法)列入食品營養強化劑新品種[9]。

目前,國內尚未有食品中維生素K2檢測的相關標準,相關檢測方法報道也較少,主要包括高效液相色譜-紫外檢測法[10-13]、毛細管電泳法[14]、高效液相色譜-質譜法[15]等。維生素K2在食品中含量極少,且易受強酸、氧化劑、堿及光的作用而分解。現有的高效液相色譜-紫外檢測法前處理采取的方法有直接萃取法和薄層純化法;直接萃取法面對的樣品主要是原料藥、納豆提取物等基質較為干凈、含量較高的樣品,而食品類別繁多、基質復雜、含量較低,直接萃取不完全、雜質干擾大;薄層純化法前處理復雜,無法滿足高通量檢測;紫外檢測器的選擇性和靈敏度不令人滿意,無法滿足食物中維生素K2的檢測需求[10-13];毛細管電泳法步驟繁瑣、重現性差;高效液相色譜-質譜法靈敏度較高,但儀器復雜、價格昂貴,不易推廣。維生素K的不飽和酮結構共軛體系較小,不能產生熒光,但能通過衍生法使維生素K同系物的母核萘琨環產生熒光,以提高其在高效液相色譜熒光檢測器上的響應值,從而達到檢測目的[16]。王琳等[17]用SnCl2的乙醇溶液將維生素K2熒光化,通過熒光檢測器成功測得人體血液中MK-4的含量。韓一秀等[18]用L-半胱氨酸將維生素K3還原為有熒光的甲萘酚,建立了用水溶液測定藥物制劑中維生素K3含量的新的熒光分析方法。

以上方法均是在前處理過程中將維生素K熒光化,本文參考AOAC Official Method 999.15[16],針對食品中MK-4、MK-7,采用柱后衍生反應使非熒光化合物維生素K2產生熒光,并結合熒光檢測器進行檢測,從而建立食物中MK-4、MK-7高效、準確、快速、靈敏的同時分離檢測技術,以期為食品中維生素K2的檢測、應用和監管提供技術支撐。

圖1 維生素K2化學結構式Fig.1 Chemical structure of vitamin K2

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉、豬肝、純牛奶、酸奶、黃油、雞蛋、豆豉、納豆 市售;MK-4標準品 美國Supelco公司;MK-7標準品 美國ChromaDex公司;脂肪酶(酶活力≥700 U/mg) 美國Sigma公司;氫氧化鉀、冰乙酸、氯化鋅、無水乙酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鈉 分析純,廣州化學試劑廠;無水乙醇 分析純,廣州光華科技股份有限公司;甲醇、正己烷、二氯甲烷 色譜純,德國Merck公司。

ThermoUltimate 3000液相色譜儀(配熒光檢測器) 美國Thermo公司;BSA224S-CW型電子分析天平北京賽多利斯公司;MS3渦旋儀、KS4000ic空氣控溫搖床 德國IKA公司;Hei-VAP真空旋轉蒸發儀 德國海道夫公司;N-EVAP112氮吹儀 中國路易公司;Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm) 美國Agilent公司;柱后鋅粉還原柱(35 mm×4.6 mm,填料為鋅粉,平均粒徑70 μm) 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品溶液制備 單標儲備液:分別準確稱取MK-4、MK-7標準品,用甲醇溶解并定容,配制質量濃度均為2000 mg/L的單標儲備液,于-20 ℃冰箱避光保存。混合標準中間溶液:分別吸取MK-4、MK-7標準儲備液1.00 mL于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,于-20 ℃冰箱避光保存。

1.2.2 樣品制備 稱取上述固體樣品約2 g、液體樣品約10 g(精確至0.0001 g)于50 mL離心管中,加入約1 g脂肪酶、10 mL去離子水,振蕩溶解,于(37±5) ℃空氣控溫搖床中酶解3 h。取出酶解好的試樣,依次加入5 mL 無水乙醇、2 mL 50%氫氧化鉀溶液,振蕩混勻,使其皂化完全。加入30 mL 正己烷,充分振搖,于5000 r/min下離心3 min,取上清液于另一50 mL離心管中,加入10 mL飽和氯化鈉溶液,振蕩水洗,于5000 r/min下離心3 min,取上清液于100 mL旋蒸瓶中。重復操作1次,合并有機相,將有機相經過無水硫酸鈉脫水過濾到旋蒸瓶中,在旋轉蒸發儀上于(40±2) ℃蒸發至近干,氮氣吹干,準確加入2.00 mL甲醇復溶,0.22 μm濾膜過濾,取濾液備用。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱后鋅粉還原柱:35 mm×4.6 mm,連接于色譜柱之后,檢測器之前;柱溫:25 ℃;流速:1.5 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:激發波長243 nm,發射波長為430 nm;流動相:甲醇(含有二氯甲烷10%、冰醋酸0.03%、氯化鋅1.5 g/L、無水乙酸鈉0.5 g/L)。

1.2.4 維生素K2含量的計算 按下列公式計算樣品中MK-4或MK-7含量:

X=c×V×d×100/m

式中,X為樣品中MK-4或MK-7含量(μg/100 g),c為待測液中MK-4或MK-7的質量濃度(μg/mL),V為樣品定容體積(mL),d為稀釋倍數,m為樣品稱樣量(g)。

1.3 數據處理

通過與儀器配套的Chromeleon 7工作站軟件完成數據的采集與處理。

2 結果與討論

2.1 酶解條件的選擇

維生素K2是脂溶性維生素,在食品中與脂質共存。脂肪酶可有效降解食品中脂肪,但酶的用量及酶解時間對維生素K2的提取有一定影響。本文以雞蛋為樣品,考察了不同用量(0.5、1.0、1.5 g)的酶(見表1)和不同酶解時間(1、2、3、4、5 h)下樣品的測定結果(見表1)。結果表明,在相同酶解時間條件下(5 h),樣品在酶用量為1.0 g時可酶解完全。且實驗過程發現,酶的用量與樣品萃取過程中乳化現象有關,酶用量的增加可有效消除乳化現象的產生,有利于萃取過程中的液液分層。結合經濟考慮,本文選取1.0 g酶用量。在相同酶用量條件下(酶用量1.0 g),酶解1、2 h結果偏低,酶解時間不足導致樣品酶解不完全。酶解3、4、5 h樣品測定結果趨于穩定,結合考慮時間效率問題,本文選取酶解時間為3 h。

表1 酶解條件的比較Table 1 Comparison of enzyme solution conditions

2.2 皂化條件的選擇

食品中維生素K2常與脂質共存,極少以游離態形式存在,且食品中其他類脂類化合物的存在也是維生素K2檢測的干擾來源,因此需要對食品進行皂化,破壞維生素K2外的包被物質,使維生素K2游離出來。在皂化反應中,堿的作用是將酶解后的脂肪轉化成脂肪酸鹽,將維生素K2釋放出來,以便于萃取。由于維生素K2對堿敏感[2],本文選用雞蛋為樣品,選擇50%氫氧化鉀溶液為堿液,對堿的用量(1、2、3、4、5 mL)進行了考察(見表2)。結果表明,當堿用量1 mL時,結果偏低,這可能與堿用量不夠、樣品皂化不完全有關。堿用量2 mL可以滿足實驗需求。堿用量3、4、5 mL結果逐漸遞減,可能與堿液含量過高,維生素K2被堿破壞有關。綜合考量,本文選擇使用2 mL 50%氫氧化鉀溶液。

表2 皂化條件的比較Table 2 Comparison of saponification conditions

2.3 流動相的選擇

考察甲醇(A,見圖2)、甲醇(含二氯甲烷5%)(B,見圖2)、甲醇(含二氯甲烷10%)(C,見圖2)、甲醇(含二氯甲烷15%)(D,見圖2)(均含有冰醋酸0.03%、氯化鋅1.5 g/L、無水乙酸鈉0.5 g/L)條件下目標峰分離度及出峰時間。結果表明,MK-4、MK-7在所有流動相條件下均可有效分離,流動相中添加二氯甲烷可有效改善峰形。隨著二氯甲烷比例的增加,目標峰出峰時間加快。考慮到二氯甲烷對儀器管路具有腐蝕作用,本文選擇使用甲醇(含有二氯甲烷10%、冰醋酸0.03%、氯化鋅1.5 g/L、無水乙酸鈉0.5 g/L)為流動相。在該條件下,MK-4的出峰時間為3.560 min,MK-7的出峰時間為11.332 min,表明該色譜條件有效可行(見圖2,C)。

圖2 MK-4、MK-7標準品色譜圖Fig.2 Standard chromatogram of MK-4,MK-7

2.4 線性關系、檢出限及定量限

將混合標準中間溶液逐級稀釋成濃度為0.02～2.00 μg/mL的系列工作液,在1.2.3的色譜條件下檢測,根據各峰面積(y)對質量濃度(x)進行線性回歸,得到MK-4、MK-7的標準曲線方程、線性范圍和相關系數。MK-4標準工作溶液線性回歸方程為:y=1.37×106x-4.49×103,相關系數r=1.0000。MK-7標準工作溶液線性回歸方程為:y=6.01×105x-2.58×103,相關系數r=1.0000。檢出限和定量限分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計,結果表明,當取樣量為2 g,定容2 mL時,MK-4的檢出限為0.01 μg/100 g,定量限為0.04 μg/100 g;MK-7的檢出限為0.06 μg/100 g,定量限為0.2 μg/100 g。當取樣量為10 g,定容2 mL時,MK-4的檢出限為0.002 μg/100 g,定量限為0.008 μg/100 g;MK-7的檢出限為0.012 μg/100 g,定量限為0.04 μg/100 g。

表3 雞蛋和豆豉中維生素K2的加標回收率和相對標準偏差(n=3)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of VK2 in eggs and fermented soya beans(n=3)

2.5 回收率與精密度

根據2.6實際樣品的測定結果,選取雞蛋、豆豉做加標實驗考察方法準確度。雞蛋中含有MK-4,不含MK-7,向雞蛋中添加0.5、1、2倍含量的MK-4,選取標準曲線低、中、高含量添加MK-7。豆豉中不含MK-4,含有MK-7,向豆豉中添加標準曲線低、中、高含量的MK-4,按0.5、1、2倍含量添加MK-7。每個水平平行3份(見表3)。MK-4的加標回收率在85.8%～94.1%之間,MK-7的加標回收率在80.6%～95.5%之間,精密度RSD均不超過3.56%,結果表明該方法回收率良好,精密度較高,實驗結果準確。

2.6 穩定性

取上述加標樣液,于-20 ℃避光分別保存0、4、8、12和24 h,考察樣品中MK-4、MK-7的穩定性(見表4)。結果發現,在24 h內,MK-4、MK-7含量的相對標準偏差(RSD)均不超過8.69%,說明MK-4、MK-7的穩定性好。

表4 提取液存放時間對維生素K2含量的影響(n=3)Table 4 Effect of different storage time on the contents of VK2(n=3)

表5 8種食品中維生素K2的含量(μg/100 g,n=6)Table 5 Contents of VK2 in the 8 kinds of food(μg/100 g,n=6)

注:ND表示未檢測到。

2.7 實際樣品的測定

本方法選取豬肉、豬肝、純牛奶、酸奶、黃油、雞蛋、豆豉、納豆8種樣品進行檢測(見表5)。結果表明,豬肉、純牛奶、酸奶、黃油、雞蛋中僅含有MK-4,其中純牛奶中含量最低,僅為(0.34±0.02) μg/100 g,雞蛋中含量最高,達(25.38±0.85) μg/100 g。豬肝、豆豉、納豆中僅含MK-7,其中豬肝含量較低,為(25.45±0.83) μg/100 g,納豆中含量最為豐富,高達(923.20±11.45) μg/100 g。本文所測樣品中維生素K2含量與Schurgers等[3]、Peter等[19]的研究結果相符。

3 結論

本文建立了高效液相色譜-熒光檢測法同時分離檢測食品中2種維生素K2(MK-4、MK-7)的分析方法。MK-4、MK-7在15 min內分離出峰。2種維生素K2在各自的線性范圍內關系良好,相關系數r=1.0000。檢出限和定量限分別以3倍和10倍信噪比(S/N)計,當取樣量為2 g,定容2 mL時,MK-4的檢出限為0.01 μg/100 g,定量限為0.04 μg/100 g;MK-7的檢出限為0.06 μg/100 g,定量限為0.2 μg/100 g。當取樣量為10 g,定容2 mL時,MK-4的檢出限為0.002 μg/100 g,定量限為0.008 μg/100 g;MK-7的檢出限為0.012 μg/100 g,定量限為0.04 μg/100 g,精密度(RSD)均不超過3.56%,回收率為80.6%～95.5%。方法對豬肉、豬肝、純牛奶、酸奶、黃油、雞蛋、豆豉、納豆8種樣品進行檢測,檢測結果表明,豬肉、純牛奶、酸奶、黃油、雞蛋中僅含有MK-4,其中純牛奶中含量最低,僅為(0.34±0.02) μg/100 g,雞蛋中含量最高,達(25.38±0.85) μg/100 g。豬肝、豆豉、納豆中僅含MK-7,其中豬肝含量較低,為(25.45±0.83) μg/100 g,納豆中含量最為豐富,高達(923.20±11.45) μg/100 g。綜上所述,該方法線性范圍廣,精密度和準確度良好,分析時間快,可進一步用于食品中維生素K2的研究。