SPE結合超高效液相色譜-質譜/質譜儀測定雞蛋中的萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量

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(1.天津中醫藥大學,天津 301617;2.天津嘉氏堂科技有限公司,天津 300193;3.長春海關(原吉林檢驗檢疫局),吉林長春 130012)

萬古霉素和去甲萬古霉素均屬于三環糖肽類抗生素[1],含有多個氨基酸和堿性的伯氨基團,呈弱堿性[2]。萬古霉素和去甲萬古霉素是革蘭氏陽性球菌的天敵,對絕大多數革蘭陽性菌有很好的體外抗菌活性[3],在臨床上通常被用作經β-內酰胺類抗生素或其它抗菌藥物治療失敗后最后才使用的藥物,即用于治療對其他抗生素不敏感的革蘭氏陽性菌所引起的嚴重致命性感染,故常被認為是“最后一線”藥物[4]。

隨著動物性食品需求的急劇增長,抗生素類藥物的不合理使用、濫用以及不遵守休藥期等多種原因所導致的食品安全問題越來越多。研究表明,長期攝入低劑量萬古霉素類藥物殘留的產品,會導致藥物在人體內緩慢蓄積,從而引起器官功能紊亂,影響公眾健康[5]。因此,動物源食品中萬古毒素類藥物殘留的控制也越來越受到關注。萬古毒素被農業部第560號公告規定為禁用獸藥[6],也被列入衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑名單(第1～5批匯總)》[7]。

抗生素廣泛用于養殖業,具有促進其生長、抗菌和抗蟲害等方面作用,在雞肉和雞蛋調查研究中均有發現四環素類、磺胺等抗生素,嚴重影響人體健康和進出口貿易[8-9]。目前萬古霉素和去甲萬古霉素的測定對象主要集中在血液[10]、腦脊液[11]研究上,其他基質較多的是動物源食品[12]、豬肉[13-14]、魚[15]、蝦[16]、飼料[17]、乳制品[18]等,雞蛋中的研究未見報道。雞蛋屬于動物源食品,基質比較復雜,蛋白質、脂肪等含量較高,基質效應嚴重,需要進一步凈化。動物源食品常用的凈化方法有固相萃取技術(SPE)、基質固相分散提取技術(MSDP)和凝膠滲透色譜法(GPC)等[19]。SPE操作簡便、快速,對痕量分析具有一定優勢。

因此,本文采用SPE凈化方式對雞蛋基質進行凈化,結合超高效液相色譜-質譜/質譜儀(UPLC-/MS/MS)測定雞蛋中萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量,以期為雞蛋中萬古霉素和去甲萬古霉素的質量控制提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

API4500超高效液相色譜-質譜/質譜儀 美國AB公司;Milli Q型超純水器 美國Millipore公司;Allegra X-22R型冷凍離心機 美國Beckman公司;Vortex-Genie 2型渦旋混勻器 美國Scientific Industries公司;OA-SYS型氮吹儀 美國Organomation公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 分別精密稱取適量萬古霉素和去甲萬古霉素,加甲醇溶解,并定容于25 mL容量瓶中,作為萬古霉素和去甲萬古霉素標準儲備液。精密移取適量萬古霉素和去甲萬古霉素標準儲備液于25 mL容量瓶中,加甲醇定容,稀釋為5 mg/L的混合標準中間液,分裝于進樣小瓶中備用。用0.1%甲酸水∶乙腈溶液=95∶5 (V/V)將混合標準中間液稀釋成5、10、20、50、100 μg/L混合標準工作溶液,現配現用。

1.2.2 樣品提取與凈化 稱取約5 g雞蛋液(精確至0.01 g)于離心管中,加入20 mL 0.1%甲酸水,渦旋混合2 min后以15000 r/min離心10 min,取出5 mL上清液加入Strata-X-C固相萃取柱(使用前用3 mL 2%甲酸甲醇和6 mL 2%甲酸溶液活化),分別用3 mL水和3 mL甲醇以小于1 mL/min的速度淋洗,棄去,用3 mL10%氨水-甲醇溶液以小于1 mL/min的流速洗脫于氮吹管中,于40 ℃下氮吹至近干,用1 mL 0.1%甲酸水∶乙腈溶液=95∶5 (V/V)溶解,過0.22 μm濾膜,供超高液相色譜-質譜/質譜儀測定。

1.2.3 儀器條件

1.2.3.1 液相色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax SB C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm);柱溫:30 ℃;流速0.20 mL/min;進樣體積:20.0 μL;流動相A為 0.1%甲酸水溶液和B為乙腈。采用梯度洗脫方式:0～5.00 min,95% A～80% A;5.00～7.00 min,80% A～5% A;7.00～9.00 min,5% A;9.00～9.01 min,5% A～95% A。

1.2.3.2 質譜條件 離子源:電噴霧電離(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應監測(MRM);離子源溫度(TEM):550 ℃;電噴霧電壓:5500 V;使用氣體:氮氣,純度≥99.99%;氣簾氣(CUR):206.85 kPa;霧化氣(GS1):206.85 kPa;輔助氣(GS2):206.85 kPa;碰撞氣(CAD):41.37 kPa。母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表1。

1.3 數據處理

利用Analyst 1.6.2數據處理軟件(美國AB公司)處理數據,以萬古霉素或去甲萬古霉素的濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,采用外標曲線法進行回歸分析。按照標準曲線計算對雞蛋液中萬古霉素和去甲萬古霉素的含量,計算公式如下。

內部控制對于醫院的意義更多的是為了能夠落實控制目標，通過一系列的內部控制流程將經濟活動的風險進行遏制。而且醫院作為市場經濟中特殊的組織，內部控制的主要目的就是為了提升醫療質量，內部控制將會計信息質量進行提升，為資產安全提供保障。從而確保醫院的各項業務能夠在遵循法律法規的前提下進行落實，綜述就是醫院的內部控制是否具有高效的運營直接關系到醫院運營管理好壞。

表1 萬古霉素和去甲萬古霉素的質譜參數Table 1 Mass spectra parameters of vancomycin and norvancomycin

注:*為定量離子。

式中,Xi為雞蛋液中萬古霉素或去甲萬古霉素的含量,μg/kg;ci為從標準曲線得到雞蛋液中萬古霉素或去甲萬古霉素的濃度,ng/mL;V為雞蛋液最終定容體積,mL;m為最終雞蛋液代表的質量,g。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 萬古霉素、去甲萬古霉素為水溶性,微溶于甲醇,幾乎不溶于乙醇或丙酮,在pH3～5的酸性環境中穩定。以0.2%三氯乙酸溶液、0.1%甲酸水和0.1%甲酸水溶液∶乙腈=5∶5(V/V)[18]為提取溶劑,向5 g雞蛋液中加入100 μL 5 mg/L的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標準中間液,按照1.2.2項下,取5 mL上清液加入預活化的Strata-X-C固相萃取柱。圖1為不同提取溶劑的回收率結果。由圖1可知,以0.2%三氯乙酸溶液為提取溶劑時,萬古霉素和去甲萬古霉素平均回收率較低,可能是因為三氯乙酸酸性較強,影響了Strata-X-C固相萃取柱的上柱效果。以0.1%甲酸水和0.1%甲酸水溶液∶乙腈=5∶5 (V/V)為提取溶劑時,萬古霉素和去甲萬古霉素平均回收率均大于90%,符合GB/T 27404-2008附錄中回收率在60%～120%之間的要求。因此,從環保和經濟角度來考慮,最終選定0.1%甲酸水為提取溶劑。

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素在不同提取溶劑下的回收率Fig.1 Recovery rate of vancomycin and norvancomycin with different extraction solvents

2.1.2 凈化方法的選擇 以0.1%甲酸水為提取溶液,向5 g雞蛋液中加入100 μL 5 mg/L的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標準中間液,按1.2.2項下,取5 mL上清液加入預活化的PCX[16]、MCX、Strata-X-C[12]、SCX、MCT陽離子交換柱和HLB固相萃取柱。由圖2可知,使用Strata-X-C固相萃取柱時,萬古霉素和去甲萬古霉平均回收率均大于90%,而PCX、MCX、SCX、MCT陽離子交換柱和HLB固相萃取柱的平均回收率均低于90%。分析原因可能是其填料比較致密,離子交換效率較高,回收率較好。因此最終選定Strata-X-C固相萃取柱。

圖2 萬古霉素和去甲萬古霉素在不同固相萃取柱下的回收率Fig.2 Recovery rate of vancomycin and norvancomycin with different solid phase extraction columns

2.1.3 Strata-X-C固相萃取柱洗脫液體積的選擇 本方法對Strata-X-C固相萃取柱進行了淋洗曲線試驗。以0.1%甲酸水為提取溶液,向5 g雞蛋液中加入100 μL 5 mg/L的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標準中間液,按1.2.2項下條件通過Strata-X-C固相萃取柱,收集每1 mL洗脫液于單個試管中,共收集8 mL,并分別測定各段洗脫液中萬古霉素和去甲萬古霉素的含量,以確定Strata-X-C固相萃取柱凈化的洗脫收集體積。由圖3可知,3 mL洗脫液時萬古霉素和去甲萬古霉素回收率基本趨于穩定。因此,本方法確定收集3 mL洗脫液可以將萬古霉素和去甲萬古霉素全部洗脫下來。

圖3 10%醇氨水-甲醇洗脫的淋洗曲線Fig.3 Leaching curve eluted of 10% alcohol ammonia-methanol solution

2.2 色譜質譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇 本方法考查了不同色譜柱Agilent Zorbax SB C18(2.1 mm×150 mm,3.5 μm)、Aglient XDB C18(150 mm×2.1 mm,3.5 μm);Waters Xbridge C18柱(150 mm×2.1 mm,3.5 μm)的影響,結果如圖4所示。由圖4可知,三種色譜柱均可以得到較好的峰形,Aglient XDB C18峰形稍微差一些,分離度和靈敏度也稍差。但總體來說,Waters Xbridge C18柱和Agilent Zorbax SB C18柱均可以使萬古霉素和去甲萬古霉素得到基線分離,但Agilent Zorbax SB C18靈敏度較高,故選擇Agilent Zorbax SB C18作為色譜柱。

圖4 萬古霉素和去甲萬古霉素不同色譜柱的色譜圖Fig.3 Chromatogram of different columns of vancomycin and norvancomycin注:A:Agilent Zorbax SB C18色譜柱;B:Aglient XDB C18色譜柱;C:Waters Xbridge C18色譜柱;1:去甲萬古霉素;2:萬古霉素。

2.2.2 流動相的優化 在流動相中加入適量甲酸,可以在萬古霉素、去甲萬古霉素離子化過程中提供質子,提高其離子化效率,從而增加其響應強度,但甲酸含量太高也會抑制其離子化,從而降低響應強度。本方法嘗試水相中添加乙酸銨,但萬古霉素和去甲萬古霉素均不出峰,表明乙酸銨對電離產生嚴重的抑制作用。因此,本方法采用0.1%甲酸水溶液作為水相,有機相考查了甲醇和乙腈,結果如圖5所示。由圖5可知,選用乙腈時萬古霉素、去甲萬古霉素分離度更高,峰形對稱性更好,因此最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相體系。

圖5 萬古霉素和去甲萬古霉素不同有機相的色譜圖Fig.5 Chromatogram of different organic phases of vancomycin and norvancomycin注:A:甲醇;B:乙腈;1:去甲萬古霉素;2:萬古霉素。

2.2.3 質譜條件的優化 一般質譜條件優化采用1.0 μg/mL的標準溶液通過蠕動泵直接進質譜進行分析。但本方法嘗試用1.0 μg/mL的萬古霉素和去甲萬古霉素混合標準溶液直接進樣,在正離子模式下進行母離子全掃描,發現725.0和718.2的分子離子峰,但靈敏度很低,以至于無法進行子離子掃描。于是,嘗試用更大濃度的混合標準溶液進行直接進樣,直到標準溶液濃度為20.0 μg/mL時,母離子全掃描和子離子掃描時峰比較明顯。萬古霉素和去甲萬古霉素屬多肽類抗生素,是由氨基酸縮合而成的肽類物質,分子量分別為1449.2、1434.2,容易形成[M+2H]2+分子離子。由圖6可知,母離子全掃描時,m/z 725.3、718.2豐度較大,未發現[M+H]+分子離子峰。因此,選擇m/z 725.3、718.2分別作為萬古霉素和去甲萬古霉素的母離子。通過碎片離子掃描(Product Ion MS2)模式對萬古霉素施加不同碰撞能量進行掃描,由圖7可知,萬古霉素母離子m/z 725.3 產生有顯著豐度的m/z 144.1和m/z 1306.0子離子,將m/z 141.1作為定量離子。由圖8可知,去甲萬古霉素母離子m/z 718.2產生有顯著豐度的m/z 144.0和m/z 1292.3子離子,將m/z 144.0作為定量離子。最后以MRM模式優化去簇電壓、碰撞能量等質譜參數。

圖7 萬古霉素的碎片離子掃描譜圖Fig.7 Fragment ion scanning spectra of vancomycin

圖8 去甲萬古霉素的碎片離子掃描譜圖Fig.8 Fragment ion scaning spectra of norvancomycin

2.3 方法學考察

2.3.1 基質效應 高效液相色譜-質譜/質譜分析中,離子化是重要的一步。離子化過程中,常因為雜質的干擾而產生基質效應,會干擾目標化合物的離子化。稱取兩份陰性樣品,以0.1%甲酸水為提取溶液,一份添加50.0 μg/kg萬古霉素、去甲萬古霉素混合標準溶液,按照1.2.2項下方法,Strata-X-C固相萃取柱凈化,接取3 mL洗脫液。由圖9可知,本方法經凈化后,基本無基質效應,因此用標準溶液工作曲線即可進行校正,減輕了檢測人員的工作量,節省試劑和材料。

2.3.2 線性范圍、檢出限、定量限 按1.2.3項下色譜和質譜條件測定5、10、20、50、100 μg/L標準工作溶液,以質量濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得到相應的線性回歸方程和線性相關系數。萬古霉素和去甲萬古霉素在5.0～100.0 μg/L范圍內具有良好的線性關系,線性方程分別為Y=2270X+3270和Y=3270X+52.6,線性相關系數(r)分別為0.9995和0.9994。

向陰性樣品中加入適量萬古霉素和去甲萬古霉素標準品,以0.1%甲酸水為提取溶液,按照1.2.2項下方法,Strata-X-C固相萃取柱凈化,接取3 mL洗脫液,在按1.2.3項下色譜和質譜條件測定。以信噪比S/N=3計算萬古霉素和去甲萬古霉素的檢出限均為2.0 μg/kg,以信噪比S/N=10計算定量限均為5.0 μg/kg。

2.3.3 回收率與精密度 回收率采用陰性樣品,以0.1%甲酸水為提取溶液,分別添加5.0、10.0和50.0 μg/kg三個水平的萬古霉素、去甲萬古霉素混合標準溶液,按照1.2.2項下方法,Strata-X-C固相萃取柱凈化,接取3 mL洗脫液。每個水平單獨測定6次,計算回收率和精密度,結果見表2。萬古霉素和去甲萬古霉素的平均回收率分別為85.6%～91.5%和88.9%～96.3%,相對標準偏差(RSD)分別為5.6%～9.2%和3.7%～9.2%。

2.4 實際樣品的測定結果

應用本方法對15個雞蛋樣品進行了分析測定,其中萬古霉素和去甲萬古霉素均未檢出,說明作為“最后一線”藥物,萬古霉素和去甲萬古霉素在畜禽養殖使用上控制得較好。

3 結論

本文建立了SPE結合超高效液相色譜-質譜/質譜儀測定雞蛋中的萬古霉素和去甲萬古霉素殘留量的方法。本方法以0.1%甲酸水為提取溶劑,選擇Strata-X-C固相萃取柱凈化,基本無基質效應。同時,萬古霉素和去甲萬古霉素在5.0～100.0 μg/L范圍內具有良好的線性關系,檢出限均為2.0 μg/kg,定量限均為5.0 μg/kg,萬古霉素和去甲萬古霉素的平均回收率分別為85.6%～91.5%和88.9%～96.3%,相對標準偏差(RSD)分別為5.6%～9.2%和3.7%～9.2%,符合技術要求。本方法具有選擇性好、操作簡單、靈敏度高、回收率穩定等優點,適用于雞蛋中萬古霉素和去甲萬古霉素的測定。