氣相色譜法測定泊馬度胺中5種殘留溶劑

徐茂紅1,戴根來,周美云

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學院,安徽六安 237005;2.合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司,安徽合肥 230088)

泊馬度胺(Pomalidomide),化學名為3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)鄰苯二甲酰亞胺,是美國Celgene公司研發(fā)的第三代免疫調(diào)節(jié)劑,于2013年2月首次在美國獲準上市[1]。其具有抗多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細胞的關鍵功能,適用于既往接受過至少兩種藥物(包括來那度胺、硼替佐米)且最近治療進行中或治療完成60 d內(nèi)疾病進展的多發(fā)性骨髓瘤患者[2]。泊馬度胺的生產(chǎn)工藝復雜,生產(chǎn)過程使用多種有機溶劑,如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)等[3-6]。根據(jù)人用藥品注冊技術規(guī)范國際協(xié)調(diào)會(ICH)要求,必須對殘留溶劑進行檢測,以保障用藥安全。經(jīng)文獻調(diào)研,關于泊馬度胺原料中殘留溶劑的測定方法雖有報道,但文獻中研究的殘留溶劑種類較少,且未包含本研究中的溶劑,各國藥典也均未收載。在泊馬度胺合成過程中使用的有機溶劑多達十余種,采用同一種方法檢測所有溶劑很難實現(xiàn)。本文在預試驗的基礎上,采用氣相色譜法一次性測定甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸5種溶劑殘留量,依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)對原料藥中殘留溶劑測定的要求[7],進行了系統(tǒng)的方法學驗證,以期為泊馬度胺的生產(chǎn)工藝改進和質量標準制定提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泊馬度胺樣品(3批批號分別為130301、130302、130303) 合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司;二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸 均為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司。

HP1890氣相色譜儀 惠普上海分析儀器有限公司;METTLER AB135-S 十萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent DB-624(30 m×0.53 mm×3.0 μm),FID 檢測器,以氮氣為載氣,流速4.0 mL·min-1,程序升溫,起始溫度為70 ℃,維持5 min,以每分鐘10 ℃的速率升溫至220 ℃,220 ℃維持10 min;進樣口溫度為180 ℃;檢測器溫度為250 ℃,進樣量1 μL。氮氣流量:30 mL·min-1,氫氣流量:30 mL·min-1,空氣流量:300 mL·min-1[8]。

1.2.2 溶液制備 單標溶液的制備:取甲醇300 mg、乙醇500 mg、乙酸乙酯500 mg、二氧六環(huán)38 mg、乙酸500 mg,精密稱定,分別置于不同含有適量二甲基亞砜的100 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,作為單標貯備液。精密量取單標貯備液5 mL,置50 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL約含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氧六環(huán)38 μg、乙酸500 μg的溶液,作為單標溶液。

混合標準品溶液的制備:取甲醇300 mg、乙醇500 mg、乙酸乙酯500 mg、二氧六環(huán)38 mg、乙酸500 mg,精密稱定,置于同一含有適量二甲基亞砜的100 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液5 mL,置于50 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL約含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氧六環(huán)38 μg、乙酸500 μg的混合溶液,作為混合對照品溶液。

供試品溶液的制備:取泊馬度胺約1.0 g,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 專屬性考察

分別取“1.2.2”項下單標溶液、混合標準品溶液、供試品溶液與空白溶劑(二甲基亞砜),照“1.2.1”項下的色譜條件進行檢測,記錄色譜圖,確定各單標保留時間,計算各組分峰的分離度(R,R=2(tR2-tR1)/(W1+W2))。2015版《中國藥典》(四部)規(guī)定,GC法檢測理論塔板數(shù)大于5000、分離度大于1.5滿足要求。結果顯示:空白溶劑及樣品無干擾,各組分峰理論塔板數(shù)和分離度均符合2015年版《中國藥典》要求,最小分離度R=4.000>1.5,各峰的理論塔板數(shù)分別為16919、13323、13901、16701、74032;各峰分離度分別為4.000、13.647、12.710、23.899。空白試劑、供試品溶液、混合標準溶液的GC圖譜見圖1,保留時間及分離度結果見表1。

圖1 空白溶劑(A)、供試品溶液(B)和混合溶液(C)的GC圖譜Fig.1 GC chromatograms of blank solution(A),pomalidomide bulks drug(B)and mixed solution(C)

表1 專屬性測定結果Table 1 The results of specificity test

表2 殘留溶劑定量限、檢測限及線性方程研究結果Table 2 The limits of quantitation,the limits of detection and the linear equation results of residual solvents

2.2 定量限、檢測限以及線性關系考察

取“1.2.2”項下溶液,逐級稀釋,按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,以信噪比S/N=10測得殘留溶劑定量限;以信噪比S/N=3測得殘留溶劑檢測限。

用二甲基亞砜將“1.2.2”項下對照品貯備液分別稀釋成濃度為甲醇76.28～610.20 μg·mL-1,乙醇126.38～1011.00 μg·mL-1,乙酸乙酯127.53～1020.20 μg·mL-1,二氧六環(huán)10.30～82.40 μg·mL-1,乙酸126.5～1012.40 μg·mL-1的系列標準溶液。分別取配制好的系列標準溶液1 μL,按“1.2.1”項色譜條件分別進樣,進行測定。分別以甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)與乙酸峰面積(A)為縱坐標,質量濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標繪制標準曲線,結果甲醇在76.28～610.20 μg·mL-1、乙醇在126.38～1011.00 μg·mL-1、乙酸乙酯在127.53～1020.20 μg·mL-1、二氧六環(huán)在10.30～82.40 μg·mL-1、乙酸在126.5～1012.40 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關系良好,相關系數(shù)均不小于0.995。結果見表2。

2.3 精密度試驗

取“1.2.2”項下混合對照品溶液,連續(xù)進樣6針,記錄色譜圖及峰面積,結果見表3。

由表3可知,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸峰面積的RSD均小于10.0%,表明該方法精密度良好。

2.4 重復性實驗

取同批次泊馬度胺6份,按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項下色譜條件方法進樣,記錄色譜圖并計算RSD,結果見表4。

表4 重復性試驗結果Table 4 Repeatability test results

由表4可知,甲醇、乙醇殘留少量,RSD小于10.0%,乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸均未檢出,說明該方法重復性良好。

2.5 回收率實驗

取“2.4項”下的泊馬度胺樣品9份,每份約1.0 g,精密稱定,置10 mL量瓶中,分別精密加入混合對照品貯備液1、2、3 mL(每個濃度各3份),加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為50%、100%、150%的加樣供試品溶液。按“1.2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,按外標法計算含量,并計算回收率,結果見表5～表9。

表5 甲醇回收率試驗結果Table 5 Methanol recovery test results

表6 乙醇回收率測定結果Table 6 Ethanol recovery test results

表7 乙酸乙酯回收率測定結果Table 7 Ethyl acetate recovery test results

綜合表5～表9,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸在50%～150%濃度范圍內(nèi),平均回收率分別為100.9%、97.95%、100.0%、98.79%、98.90%,平均回收率介于97.0%～110.0%之間,說明本方法回收率良好。

2.6 耐用性

按“1.2.1”項下色譜條件,適當調(diào)整分析條件,取“1.2.2”項下混合對照品溶液進樣,考察分離度變化情況,評估測試結果受分析條件的變化影響程度,測定結果見表10。

表10 耐用性試驗結果Table 10 The results of durability test for GC

結果表明儀器分析條件適當變動,各色譜峰之間相鄰峰之間最小的分離度均遠大于1.5的要求,表明本法對色譜峰之間的分離滿足《中國藥典》2015年版的要求,故儀器的起始柱溫與載氣流速出現(xiàn)微小的偏差對試驗的檢測結果無影響。

表8 二氧六環(huán)回收率測定結果Table 8 Two oxygen and six rings recovery test results

表9 乙酸回收率測定結果Table 9 Acetic acid recovery test results

2.7 樣品測定

取中試三批泊馬度胺樣品,按“1.2.2”項下供試品溶液與對照品溶液制備方法制備供試品溶液與對照品溶液,按“1.2.1”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖,測定峰面積,外標法計算。分析測定結果見表11。

表11 泊馬度胺原料殘留溶劑測定結果(%)Table 11 The determination results of residual solvents in pomalidomide

根據(jù)《中國藥典》2015年版四部附錄0861殘留溶劑的限度規(guī)定,泊馬度胺質量標準中規(guī)定殘留溶劑甲醇不得超過0.3%、乙醇不得超過0.5%、乙酸乙酯不得超過0.5%、二氧六環(huán)不得超過0.038%、乙酸不得超過0.5%。結果表明,中試三批泊馬度胺此5種溶劑殘留均符合泊馬度胺原料藥質量標準以及《中國藥典》2015年版的規(guī)定。

3 結論

泊馬度胺中殘留溶劑乙酸、甲醇、乙醇與二氧六環(huán)、乙酸乙酯極性差別較大,在分離過程中選用極性過大或過小的色譜柱都不能實現(xiàn)較好的分離。經(jīng)多次嘗試并結合文獻資料[9],本研究選用中等極性的DB-624色譜柱達到較好的分離效果。

不同沸點的溶劑分離快慢不同,低沸點的先分離,高沸點的后分離。甲醇沸點64.7 ℃,乙醇與乙酸乙酯沸點接近,二氧六環(huán)與乙酸沸點較高,最先分離出的是甲醇,最后分離出的是乙酸。經(jīng)多次預試驗設置起始溫度為70 ℃,不同時間段測定對分離度影響較小,分離效果較好。

在預試的基礎上對分析方法進行專屬性、檢測限、定量限、線性和范圍、精密度、準確度及耐用性等考察驗證,結果在專屬性試驗中各溶劑能有效地分離(分離度大于1.5)、互不干擾,空白溶劑對檢測溶劑均無影響;檢測限與定量限均遠低于檢測時的樣品溶劑限度;線性關系的相關系數(shù)均大于0.995;儀器與方法精密度良好,RSD均小于10.0%;各溶劑的回收率均在90%～110%之間,符合2015版《中國藥典》規(guī)定在80%～120%之間的要求,表明準確度良好;另適當改變起始柱溫與載氣流速,分離度均達到要求。本方法簡單準確、靈敏度高、專屬性強,能滿足2015年版《中國藥典》對溶劑殘留檢測的實驗要求。

經(jīng)過對三批中試樣品的檢測,此5種殘留溶劑達到2015年版《中國藥典》的限度要求,故本方法適于泊馬度胺合成過程中有機溶劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)與乙酸殘留量的檢測,可作為泊馬度胺質量控制的技術參考。