真空包裝獅子頭貨架期預測模型的建立

楊 歡,劉 毅,邵樂樂,戴瑞彤

(中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083)

獅子頭是淮揚菜系中的傳統菜肴,在揚州“三頭宴”中最為著名[1]。傳統獅子頭通常以豬肉為主料,經過切粒、腌制、成型后熟制而成,屬于熟制的肉丸制品,因其具有肥而不膩、軟嫩爽口、四季皆宜、加工方式多樣等特點,深受消費者喜愛。目前市場上已經出現一些真空包裝的獅子頭產品,既便攜即食,又能夠最大程度地保留獅子頭原有風味和品質。但獅子頭中水分含量較高,為微生物生長繁殖提供了良好條件,不當的貯藏溫度極易引起其腐敗變質,引發食品安全隱患,危害人體健康[2]。因此,構建不同貯藏溫度下獅子頭產品的微生物生長預測模型對預判食品貨架期、提高食品的安全穩定性具有重要意義。

預測食品微生物學(predictive food microbiology,PFM)用數學方法描述特定條件下食品中微生物的生長規律,通過建立數學模型,不需要進行傳統檢測就能快速判斷微生物的生長情況,并準確預測產品的貨架期[3]。1993年Whiting和Buchenan將模型劃分為三個等級[4],一級模型為微生物的生長模型,描述微生物數量與時間之間的函數關系,常見的一級模型為線性模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic模型以及Baranyi模型。二級模型為微生物的生長動力學模型,表達的是環境條件對一級模型中參數的影響,其中平方根模型的使用最為廣泛。三級模型是在一級和二級模型基礎上建立的應用系統。

目前關于微生物預測模型的研究多集中于水產品[5-7]、生鮮肉[8-10]以及少數散裝熟肉制品[11-13]等方面,而對于真空包裝的中國傳統熟肉制品卻很少見。對肉制品建立的微生物預測模型大多都是以液體的肉湯培養基作為基質,該方法雖然便于操作,但是液體培養基較為單一,忽略了原料肉成分的復雜性及其對微生物的影響,目前已有較多研究證實由液體培養基中獲得的實驗數據會高于原料肉中微生物生長的真實情況[14],進而導致預估的保質期與實際偏差較大。也有學者通過向原料肉中接種特定菌株來構建模型,但該方法接種的通常為一株菌株,而導致食品腐敗的微生物并不是單一的,各種微生物之間會互相影響,因此以一種微生物為對象構建生長模型并不能很好地體現原料肉中所有微生物的真實生長狀況;此外很多研究表明,在不同貯藏溫度下,食品中微生物的種類和數目存在差異,隨著貯藏溫度的改變,肉制品中優勢腐敗菌的種類和數量也可能會發生變化[15-19]。因此選擇單一菌種作為建模對象不具有代表性,無法推算出食品準確的貨架期[20]。直接從原料肉中獲得微生物數據則可以忽略基質和微生物間相互作用帶來的影響,使模型更具可信性和準確性。

本研究直接從獅子頭原料中獲得實驗數據,分別用線性模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic模型以及Baranyi模型對4、10、15、20、25 ℃貯存條件下獅子頭中的菌落總數進行一級方程的擬合,采用平方根模型描述溫度對微生物生長速率和延滯期的影響,并通過決定系數R2、殘差平方和(residual sum of squares,RSS),均方根誤差(root mean square error,RMSE)、準確因子(accuracy factor,Af)、偏差因子(bias factor,Bf)、赤池信息量準則(kaike information criterion,AIC)以及貝葉斯信息準則(bayesian information criterion,BIC)對模型進行評價和驗證,進而選擇最優模型,并以此為基礎建立真空包裝獅子頭的貨架期預測模型,以期為提高獅子頭食用安全性提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬后臀尖肉、豬背膘脂肪、雞蛋、淀粉、調味料(食鹽、醬油、料酒、白砂糖、蔥姜等) 北京美廉美超市;鋁箔袋、無菌拍打袋、一次性無菌培養皿 北京索萊寶科技有限公司;平板計數瓊脂 北京奧博星生物技術有限責任公司;氯化鈉 北京化工廠。

EF-12型電炸鍋 Topkitchen公司;PIB02型電磁爐 上海奔騰電器有限公司;TP300筆式探針溫度計 武強縣華洋儀表廠;HH-W600數顯恒溫水浴箱 金壇市科析儀器有限公司;RS-400型真空包裝機 北京日上科貿公司;LDZH-100L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;YP6002型電子天平 上海佑科儀器儀表有限公司;西班牙IUL Masticator均質器(拍打式) 上海川翔生物科技有限公司;移液槍 美國Eppendorf公司;DHP-9082型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;YT-CJ-2ND型超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備 獅子頭的制作參考侯曼[21]的方法并做適當修改:將豬后臀尖肉與豬背膘脂肪分別攪成肉糜,按照質量比6∶4混合后,加入10%的蛋液、1.5%食鹽、2%淀粉、2%醬油、2%料酒、1%蔥末、1%姜末和10%的純凈水(以混合后豬肉糜質量為100,w/w),攪拌均勻,取適量肉餡團成60 g左右肉丸,每次將四個肉丸放入180 ℃油鍋中炸2 min,待其表面呈金黃色后取出。冷卻后取30個炸制后的肉丸置于裝有3000 g水的鍋(水溫85 ℃,含60 g蔥段、60 g姜片和30 g醬油)中煮制。待肉丸中心溫度為72 ℃時撈出,裝入無菌包裝袋中真空包裝,在85 ℃水浴鍋中進行二次殺菌15 min,冷卻后分別置于4、10、15、20、25 ℃培養箱中貯藏,在設定的取樣點取三袋樣品進行實驗。

1.2.2 菌落總數測定 菌落總數的測定參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》方法[22]。

1.3 模型的擬合

1.3.1 一級模型的擬合 一級模型僅考慮微生物的生長情況,本文對獅子頭貯藏期間菌落總數分別采用線性模型、經驗模型中的修正Gompertz模型和修正Logistic模型以及機理模型中Baranyi模型進行擬合。

1.3.1.1 線性模型 線性方程的表達式為[23]:

Nt=N0+μt

式(1)

式中:Nt為t時刻時菌數的對數值,lg(CFU/g);N0為隨時間無限減小時的漸進對數值,相當于初始菌落,lg(CFU/g);μ為微生物的生長速率,d-1;t為貯藏時間,d。

1.3.1.2 修正的Gompertz模型 修正的Gompertz模型表達式如下[24-25]:

Nt=N0+(Nmax-N0)

式(2)

式中:Nt為t時刻時菌數的對數值,lg(CFU/g);N0為初始菌落數對數值,lg(CFU/g);Nmax為穩定期時的最大菌落數對數值,lg(CFU/g);μmax為微生物生長的最大比生長速率,d-1;λ為微生物生長的遲滯時間,d-1;t為貯藏時間,d。

1.3.1.3 修正的Logistic模型 修正的Logistic模型表達式為[26-27]:

式(3)

式中:Nt為t時刻時菌數的對數值,lg(CFU/g);N0和Nmax分別為初始菌落數和最大菌落數的對數值,lg(CFU/g);u為當t為M時的最大比生長速率,d-1;M為微生物達到最大比生長速率所需要的時間,d;t為貯藏時間,d。

基于上述參數,由如下公式計算最大比生長速率和遲滯時間:

式(4)

式(5)

式中:μmax為最大比生長速率,d-1;λ為恒溫條件下的遲滯時間,d。

1.3.1.4 Baranyi模型 Baranyi方程如下[28]:

Nt=N0+μmax+ln[exp(-μmaxt)+exp(-μmaxλ)-exp(-μmax-μmaxλ)]-ln{1+[exp(μmaxλ-μmaxλ)-exp((-μmaxλ)]/exp(Nmax-N0)}

式(6)

式中,Nt為t時刻菌數的對數值,lg(CFU/g);N0和Nmax分別為初始菌落數和最大菌落數的對數值,lg(CFU/g);μmax為最大比生長速率,d-1;λ為恒溫條件下的遲滯時間,d;t為貯藏時間,d。

1.3.2 二級模型的擬合 采用平方根模型描述最大比生長速率和遲滯時間與溫度間的線性關系,其公式如下[29]:

式(7)

式(8)

式中:T為貯藏溫度, ℃;Tminλ、Tminμ為微生物生長速度為零時的理論最低溫度, ℃;bλ、bμ為方程的常數。

1.3.3 模型的評價與驗證

1.3.3.1 模型的評價 對模型進行評價是模型建立過程中的關鍵環節,采用決定系數R2、殘差平方和(RSS),均方根誤差(RMSE)、赤池信息量準則(AIC)以及貝葉斯信息準則(BIC)綜合評估模型的擬合能力,各參數表達式如下[3,27,30]:

RSS=∑(Oi-Pi)2

式(10)

式(11)

式(12)

式(13)

式中:n是觀測點的數量;Oi是第i個數據點時的實測值;Pi是第i個數據點時的預測值;m是實測值的平均值;p是模型自變量的個數。

R2越接近于1代表擬合優度越好,通常情況下R2至少為80%才表示擬合的模型可以被接受[31]。RSS、RMSE、AIC和BIC的值越小也代表模型的擬合性較好。

1.3.3.2 模型的驗證 使用準確因子(Af)、偏差因子(Bf)對擬合的一級模型進行驗證,驗證公式如下[32]:

式(14)

式(15)

式中:N預測是通過擬合模型預測的菌落總數,(CFU/g);N實測是在相同時間下實際測得的菌落總數,(CFU/g);n為實驗次數。

Bf表示實測值與預測值的偏差程度,當Bf>1表示預測值大于實際值,Bf<1表示模型的預測值低于實際值,其值在0.9～1.05之間時表示模型擬合效果很好,在0.7～0.9和1.06～1.15范圍內表示擬合效果可以被接受[26,33]。Af則反映了預測值與實測值的接近程度,其值在1附近時的擬合效果越好,Af越高則表明模型擬合的準確度較低,通常Af在1.1～1.9范圍內可以被接受[34]。

1.3.4 貨架期預測模型的建立與驗證 在最優一級模型的基礎上,代入初始菌落數(Nmax)和腐敗限量值(Ns),計算菌落總數從初始值增加到腐敗限量值所需的時間,建立獅子頭的貨架期預測模型,公式如下:

式(16)

式中:SL代表獅子頭的貨架期,d;λ為恒溫條件下的遲滯時間,d;N0為初始菌落數對數值,lg(CFU/g);Nmax為不同溫度下最大菌落數對數值的平均值,lg(CFU/g);μmax為最大比生長速率,d-1;Ns為達到貨架期終點時的菌落總數對數值,lg(CFU/g)。

將預測得到的貨架期與實際貨架期進行比較,計算相對誤差值來驗證貨架期模型的準確性。

式(17)

1.3.5 數據處理 利用Microsoft Excel 2007軟件整理并計算實驗數據,不同溫度貯藏組實驗重復三次,圖表中數據為平均值±標準偏差。單因素方差分析采用SPSS 19.0(IBM,USA),P<0.05表示數據差異具有顯著性。采用OriginPro 8.5.0軟件(OriginLab,Northampton,Massachusetts,USA)擬合微生物生長曲線。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏溫度下真空包裝獅子頭微生物生長曲線

菌落總數的生長曲線通常包含遲滯期、對數期和穩定期,隨時間的延長大致呈現“S”型,不同貯藏溫度下,菌落總數生長曲線差異明顯。如圖1所示,貯藏初期獅子頭中菌落總數數值較低,可能油炸、煮制和滅菌等工藝殺滅了大部分的微生物。在貯藏過程中,4 ℃條件下的微生物生長速度較為緩慢,前40 d內變化不大,40 d后緩慢上升,在貯藏85 d時,菌落總數達到4.09 lg(CFU/g),超過國標GB2726-2016對熟肉制品的限量值4 lg(CFU/g)[35],在140 d時達到菌落總數的最大值。隨著貯藏溫度的升高,微生物的生長速度加快。

表1 不同一級模型擬合的相關參數Table 1 The parameters of different primary models

10 ℃條件下,貯藏32 d后菌落總數呈現顯著上升(P<0.05)。15、20、25 ℃下微生物生長的遲滯期不明顯,菌落總數從貯藏初期即迅速生長。不同貯藏溫度下微生物達到穩定期的時間隨著貯藏溫度的升高而下降,在4 ℃貯藏時菌落總數在120 d后趨于穩定,而10、15、20、25 ℃條件下到達穩定期的時間分別是64、24、16、12 d。獅子頭中的最大菌落數隨溫度的升高而升高,由4 ℃的5.21 lg(CFU/g)升高至25 ℃的7.21 lg(CFU/g),上升了2個對數級。15、20 ℃條件下獅子頭中的最大菌落數非常接近,但20 ℃貯藏的樣品菌落總數在達到最高點后出現略微下降,說明在該溫度下貯藏16 d就已經達到微生物的衰亡期,這與宋志強的試驗結果一致[6]。在25 ℃貯藏條件下,菌落總數在第15 d達到最大值,此時獅子頭出現漲袋、發粘等現象,并伴有異味產生。綜上可知溫度對于獅子頭中微生物的生長繁殖有明顯的影響。

圖1 不同溫度下菌落總數生長曲線Fig.1 Microbial growth curve at different temperatures

2.2 一級模型的擬合與評價

線性模型、修正的Gompertz模型(mGM)、修正的Logistic模型(mLM)以及Baranyi模型(BM)對不同貯藏溫度下真空包裝獅子頭中菌落總數的生長曲線擬合所得的參數值如表1所示。

由表1可知,隨著溫度升高,最大比生長速率μmax增大,遲滯期λ變短。這是因為低溫抑制了獅子頭中微生物的生長。而25 ℃是常見微生物生長較適合的溫度,因此在此溫度下貯藏初期菌落總數不斷上升。此外,溫度對微生物體內的酶也會產生影響,進而影響微生物的生長繁殖速率。另有研究表明低溫時微生物可能無法正常輸送營養物質,而溫度升高可以加強微生物的酶促反應,進而縮短遲滯期并提高其生長速率[36]。

對不同一級模型擬合得到的參數值進行比較,線性模型擬合的參數值與其他三個模型具有較大差異。mGM、mLM與BM擬合的初始菌落值和最大比生長速率值非常接近。在4、10 ℃時,mGM與mLM擬合出的遲滯期的比值接近于1,隨著溫度升高該比值不斷變大,20 ℃時其值已經超過2,25 ℃時則已經臨近于3。BM擬合得到的遲滯期明顯低于mGM和mLM,其中BM擬合25 ℃貯存樣品所得的遲滯時間為-0.04 d,但該值不可能為負值,由此表明BM擬合失敗。

對使用不同一級模型擬合出的參數進行評價,其結果如表2所示。在三種模型中線性模型的R2值最低,在20 ℃時僅為0.5551,且其RSS、RMSE、AIC和BIC值均較高,表明線性模型不適用于獅子頭貯藏期間菌落總數的擬合。而mGM與mLM中這四個參數的數值相差不大,其R2值均在97%以上,表明兩種模型都可以較好地擬合不同溫度下微生物的生長情況,需進一步比較其二級模型的擬合效果確定最優模型。

表2 不同一級模型擬合結果評價參數的比較Table 2 Comparison of the evaluation parameters of different primary models

表3 不同二級模型方程及其擬合的相關參數Table 3 The equations and parameters of different secondary models

2.3 二級模型的擬合與評價

二級模型描述了一級模型擬合出的參數與環境條件(溫度、pH、水分活度等)之間的函數關系。本文在一級模型的基礎上,使用平方根模型將由mGM和mLM擬合得到的最大比生長速率和遲滯期分別與溫度進行線性擬合,觀察溫度對兩個參數的影響,并比較其擬合效果,選出最優模型。擬合效果圖見圖2和圖3。

圖2 修正的Gompertz模型下溫度與最大比生長速率(A)和遲滯期(B)的關系Fig.2 Relationship between temperature and specific growth rate(A)and lag phase(B)derived from modified Gompertz model

圖3 修正的Logistic模型下溫度與最大比生長速率(A)和遲滯期(B)的關系Fig.3 Relationship between temperature and specific growth rate(A)and lag phase(B)derived from modified Logistic model

平方根模型的方程式及評價參數如表3所示。

表3為分別以mGM和mLM為基礎采用平方根模型擬合所得方程的相關參數。在由mLM中的參數擬合得到的二級模型中,溫度與最大比生長速率擬合得到的線性方程的R2達0.9562,但溫度與遲滯期的線性關系較差,其R2僅為0.8642,表明mLM擬合所得方程效果不是很好。在由采用mGM擬合參數得到的二級模型中,兩個模型的R2分別為0.9193和0.9296,均大于0.9,且其RSS、RMSE、AIC和BIC值都相對較低。考慮到上述擬合模型R2的差異,并兼顧到RSS、RMSE、AIC和BIC等評價指標,進行平方根模型擬合時采用來自mGM的參數可以更準確地描述溫度對生長速率和遲滯期的影響。

由上述分析可知,在四種模型中,mGM擬合效果最好,因此本研究選擇mGM對獅子頭中的菌落總數進行擬合,并以此為基礎建立貨架期預測模型。微生物預測模型中,Gompertz模型和Logistic模型同屬經驗模型,在熟腌肉[26]、冷卻豬肉[37]、涼皮[38]和對蝦[39]的微生物預測研究中,Gompertz模型均表現出了較好的擬合效果,與本實驗結果一致。但目前也有研究表明經驗模型雖然可以對微生物生長數據進行較好地擬合,但缺乏生物學基礎,較難解釋擬合得到參數的生物學意義。Baranyi模型為機理模型,是了解微生物生長規律后基于細胞分裂的生長規律而建立,模型具有生物學意義。張莉等[24]、陳睿等[27]研究認為Baranyi模型擬合準確度最高,與本研究結果出現差異的原因可能是不同的數學模型適合的生物學特性并不相同,模型中的變量在微生物生長后期會失去其生物學意義,因此選擇的描述性模型越簡單越適合[40],而Baranyi模型在經驗模型的基礎上增添了線性函數,可能與真空包裝獅子頭中微生物的實際生長曲線不相符;此外微生物種類、食品基質和包裝方式的不同也會對模型的擬合效果產生影響。

2.4 模型的驗證

為了評價模型的可靠性,使用偏差因子Bf和準確因子Af對擬合的一級模型進行驗證,結果如表4所示。5種溫度下偏差因子的范圍為0.8165～1.0684,準確因子在1.1228～1.4175之間,均屬于可接受范疇,表示模型擬合的準確度較高,通過mGM獲得的菌落總數數據具有可信度,該模型可用于貨架期預測模型的建立。

表4 細菌總數預測值的偏差度與準確度Table 4 Bf and Af on predicted value of total bacterial count

2.5 貨架期預測模型的擬合與驗證

真空包裝獅子頭貨架期終點時微生物的腐敗限量值Ns采用國標GB 2726-2016中規定的限量值104CFU/g。最大菌落數Nmax取不同溫度下菌落數的平均值6.22 lg(CFU/g),由式(16)得到真空包裝獅子頭的貨架期預測模型為下式:

式(18)

為驗證該貨架期預測模型的準確性,采用不同批次的獅子頭進行模型驗證。由表5可知,貯藏在4、10、15、20、25 ℃的真空包裝獅子頭的貨架期的預測值分別為80.79、45.22、10.96、4.96、4.01 d,預測值與實測值相對誤差值的絕對值均在10%以內,表明擬合的貨架期模型可以有效的對貯藏在4～25 ℃的真空包裝獅子頭進行預測。

表5 不同貯藏溫度條件下貨架期的實測值和預測值Table 5 Predicted and observed shelf-life stored at different temperatures

3 結論

本文以不同貯藏溫度下的真空包裝獅子頭為研究對象,測定4～25 ℃條件下微生物的生長情況,分別用線性模型、修正的Gompertz模型、修正的Logistic模型以及Baranyi模型對菌落總數進行一級模型的擬合,并在此基礎上用平方根模型構建二級模型。結果表明,隨著溫度升高,微生物的繁殖速率不斷上升,遲滯期不斷縮短。對比模型擬合的評價參數,修正的Gompertz模型表現出最高的擬合優度。用準確因子(Af)及偏差因子(Bf)對模型進行驗證,表明建立的微生物預測模型具有可信性,可以快速準確地預測獅子頭中微生物的生長態勢。進一步建立獅子頭的貨架期預測模型,預測值與實測值的相對誤差均在10%以內,表明該模型可以很好地預測4～25 ℃貯藏真空包裝獅子頭的貨架期。