皺紋盤鮑腹足及內臟抗氧化活性研究

,*

(1.威海長青海洋科技股份有限公司,山東威海 264300;2.榮成市海洋與漁業局,山東威海 264300)

抗氧化肽是一類具有抗氧化活性的多肽的總稱。由于天然抗氧化肽比人工合成的抗氧化劑更加安全,近年來,關于從海洋動物蛋白質資源中提取抗氧化肽的研究屢屢見諸報端。據報道,海洋生物抗氧化肽具有多種多樣的生物學功能,如抗癌、抗腫瘤、抗高血壓、抗血栓、降膽固醇、免疫調節、抗氧化等作用[1]。

皺紋盤鮑是中國傳統的名貴食材,含有豐富的蛋白質,還含有較多的鈣、鐵、碘和維生素等營養元素[2]。其中,皺紋盤鮑內臟的體重是鮑魚的20%～30%[3],所含營養物為水、蛋白質、維生素等。鮑魚自身有很高的食用與藥用價值,可以給鮑魚產業帶來很高的經濟效益,關于鮑魚加工的研究越來越多,而同樣具有藥用價值的鮑魚內臟卻一直被當做下腳料處理,這成為鮑魚加工行業的普遍趨勢。我國對海洋資源提取抗氧化多肽的研究很多,曾慶祝等[4]研究從扇貝邊酶解物中抗氧化肽的性質,發現扇貝邊酶解物具有一定的體內抗氧化活性;楊濤等[5]從海參內臟中制備海參多肽,發現海參內臟多肽具有較好的清除自由基的能力;李哲等[6]研究從貽貝中分離純化抗菌肽,驗證了貽貝抗菌肽具有較強的抗菌性。但是還未見同時對比鮑魚腹足、內臟抗氧化多肽抗氧化性的研究。

隨著酶技術的發展,酶法水解在水產品加工及水產品下腳料綜合利用中的應用越來越廣泛[7]。對于多肽的抗氧化活性的測定方法可以分為兩類:體內測定和體外測定。體內實驗法雖然更貼近于生物體系,但是實驗成本大且復雜繁瑣,實驗周期長;體外抗氧化活性的測定方法是建立模擬體內的抗氧化反應體系的評價方法,其中評價方法有還原能力、清除羥基自由基的能力、清除DPPH自由基的能力、清除超氧陰離子的能力、半抑制濃度IC50等[8-9]。因此本文選擇測定皺紋盤鮑腹足及內臟抗氧化肽酶解液的體外抗氧化活性來評價分析皺紋盤鮑腹足、內臟抗氧化肽的抗氧化活性,為皺紋盤鮑不同部位蛋白質資源的精深加工提供理論支撐,進一步促進皺紋盤鮑養殖業的增效增收。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皺紋盤鮑 威海長青海洋科技股份有限公司;中性蛋白酶(酶活力21×104U/g) 天津諾維信生物技術有限公司;供試菌株:大腸桿菌(Escherichiacoil,菌株編號:BLZX-168) 國家海產貝類工程技術研究中心實驗室;0.1 mol/L鹽酸標準滴定溶液 天津標準科技有限公司;DPPH標準品 華夏科技有限公司;砷標準儲備液、汞標準儲備液、鉻標準儲備液、鉛標準儲備液、鎘標準儲備液 國家鋼鐵材料測試中心;石油醚、鐵氰化鉀、三氯乙酸(TCA)、氯化鐵、水楊酸、無水乙醇、維生素C、鹽酸、氫氧化鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、硝酸、鹽酸羥胺、過硫酸鉀、硼氫化鉀、甲基異丁酮、氨水、酒石酸銨、吡咯烷二硫代甲酸銨、二乙氨基二硫代甲酸鈉、乙酸、高錳酸鉀、二苯氨基脲、硫脲 國藥集團化學試劑有限公司。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;CP114型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;AL104型分析天平 上海梅特勒;UV2800SPC型紫外可見分光光度計 蘇州江東精密儀器有限公司;DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;PHSJ-3F型pH計 上海雷磁創益儀器儀表有限公司;L535-1型臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;SXT-02索氏提取器 上海洪紀儀器設備有限公司;GZS-1.0型冷凍干燥機 沈陽北冰洋食品工程有限公司;PF51型原子熒光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TAS-990 AFG型原子吸收分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 皺紋盤鮑腹足、內臟酶解液的制備 皺紋盤鮑腹足及內臟蛋白質的水解酶為中性蛋白酶。從冰箱中取出皺紋盤鮑腹足、內臟打漿處理后的原料并解凍混勻,分別稱取5 g原料加蒸餾水配制成500 mL溶液,并按酶制劑產品標注的最適條件進行酶解,充分酶解后在100 ℃條件下加熱滅酶,直至冷卻至室溫后,于離心機中4000 r/min離心10 min,取酶解上清液備用,即腹足多肽酶解液(Peptides Hydrolysate of Gastropods,PHG)、內臟多肽酶解液(Peptides Hydrolysate of Viscera,PHV),下文均用PHG、PHV來表示皺紋盤鮑腹足、內臟多肽酶解液。

1.2.2 PHG、PHV重金屬測定方法

1.2.2.1 食品中總砷及無機砷的測定 GB 5009.11-2014。

1.2.2.2 食品中總汞及有機汞的測定 GB 5009.17-2017。

1.2.2.3 食品中鉻的測定 GB 5009.123-2014。

1.2.2.4 食品中鉛的測定 GB 5009.12-2017。

1.2.2.5 食品中鎘的測定 GB 5009.15-2014。

1.2.3 PHG、PHV成分分析方法 酶解液的固化處理:對PHG、PHV進行冷凍干燥處理并細化至粉末狀固體。對PHG、PHV進行成分分析的測定時,均采用PHG、PHV固體粉末。

1.2.3.1 多肽含量的測定 參考楊濤等[5]的測定方法。

1.2.3.2 粗脂肪含量的測定 索氏抽提法(GB/T 5009.6-2003)。

1.2.3.3 多糖含量的測定 苯酚硫酸法(GB/T 9695.31-2008)。

1.2.3.4 水分含量的測定 直接干燥法(GB/T9695.15-2008)。

1.2.3.5 灰分含量的測定 灼燒法(GB/T 9695.18-2008)。

1.2.4 PHG、PHV體外抗氧化活性測定方法

1.2.4.1 還原力的測定 分別取PHG、PHV各1.0 mL于洗凈的試管中,向其中加入1.0 mL pH為6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1.0 mL 1%鐵氰化鉀K3Fe(CN)6溶液,搖勻后置于50 ℃的水浴鍋中加熱2 min。結束之后,立即放于冷水或冰浴中制冷,加入1.0 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液,搖勻充分反應之后,3000 r/min離心5 min。取上清液2.0 mL,依次加入2.0 mL的蒸餾水與0.8 mL 0.1%的氯化鐵(FeCl3)溶液,混合均勻,靜置10 min之后,于700 nm波長處測其吸光值,所測得的吸光度值的大小表征產物的還原能力。維生素C代替樣品作為陽性對照,所有反應條件同上。并用蒸餾水作為空白調零[10]。

1.2.4.2 二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)清除率的測定 稱取一定量DPPH·,用三氯甲烷配制成2 mol/L溶液,用無水乙醇稀釋成0.1 mmol/L DPPH·溶液備用。分別取0.4 mL不同濃度的PHG、PHV,向其中加入0.4 mL DPPH·溶液,充分混勻,作為樣品組;取0.4 mL不同濃度的PHG、PHV,向其中加入0.4 mL無水乙醇,充分混勻,作為對照組;取0.4 mL蒸餾水,向其中加入0.4 mL DPPH·,混合均勻,作為空白組,室溫下避光放置30 min后,8000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm測定吸光值。以維生素C作為陽性對照[11]。按以下公式計算DPPH·清除率。

式中:A為樣品組的吸光度值;A1為對照組的吸光度值;A0為空白組的吸光度值。

1.2.4.3 羥基自由基清除率的測定 樣品組的反應體系為9 mmol/L FeSO40.2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.2 mL,不同濃度的PHG、PHV 0.2 mL以及0.1 mol/L PBS(pH6.6)1.2 mL。以等量的0.1 mol/L PBS(pH6.6)代替除PHG、PHV外的反應體系作為對照組;以等量0.1 mol/L PBS(pH6.6)作為空白組;最后加入8.8 mmol/L H2O20.2 mL啟動反應,置于37 ℃水浴加熱30 min,8000 r/min離心10 min。取其上清液于510 nm波長下比色。以維生素C為陽性對照[12]。按以下公式計算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率(%)=(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)×100

式中:A樣品為樣品組的吸光度值;A對照為對照組的吸光度值;A空白為空白組的吸光度值。

1.2.4.4 超氧陰離子自由基清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[13]。1.0 mL PHG、PHV與9.0 mL 50.0 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2)混合,取出3 mL的混合溶液,向其中加入0.1 mL鄰苯三酚溶液(60 mmol/L),在室溫下迅速振蕩反應4 min,測定320 nm下該混合溶液的吸光度值A1,空白對照為相同條件下1.0 mL去離子水替代PHG、PHV測得的吸光度值A0。按以下公式計算超氧陰離子自由基清除率。

超氧陰離子自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100

式中:A1為PHG、PHV的吸光度值;A0為空白對照的吸光度值。

1.2.4.5 脂質氧化抑制率的測定 脂質氧化抑制率測定采用硫氰酸銨比色法[14],將PHG、PHV溶于2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH7.0)中,倒入到10 mL具塞比色管中,然后加入50 mmol/L 2.5 mL亞油酸(溶于95%乙醇)溶液,混勻之后加入1.25 mL蒸餾水,將上述反應液放置于45 ℃培養箱中,反應48 h后測定亞油酸的氧化程度,取0.1 mL反應液,加0.1 mL 30%的硫氰酸銨溶液,然后加入4.7 mL 75%的乙醇溶液,最后將其加入0.1 mL 0.02 mol/L氯化亞鐵(內含3.5%的鹽酸)溶液中,充分振蕩,反應3 min后,在波長500 nm處測定吸光度值。按以下公式計算脂質氧化抑制率。

式中:A48未和A0未分別代表未加PHG、PHV的空白組在0、48 h的吸光度值;A48和A0分別為加入PHG、PHV后在0、48 h測得的吸光度值。

1.2.4.6 Fe2+螯合率的測定 向反應體系中分別加入2 mL FeSO4溶液(20 mmol/L),2 mL菲咯臻溶液(0.5 mmol/mL)和1 mL 2%的抑制物,空白對照組中加入同體積的蒸餾水來替代抑制物[15]。按以下公式計算Fe2+的螯合率。

式中:A0為空白對照組的吸光度值;An為加入PHG、PHV溶液后的吸光度值。

1.2.5 PHG、PHV對細菌的抑制作用 采用瓊脂擴散法測定抑菌圈的大小[16]。將冷凍保存于-80 ℃下的供試菌株:大腸桿菌在LB固體培養基上劃線,置于30 ℃下培養24 h。從活化后的平板上挑取單菌落,接種于25 mL的LB液體培養基中,于30 ℃、200 r/min下搖菌24 h。以含1%瓊脂的LB培養基為下層培養基,向含0.7%瓊脂的LB培養基中接種供試菌株(100 mL培養基中加入1 mL菌株密度為106CFU/mL的供試菌液),搖勻后制成上層培養基,用打孔器在平板上打孔,孔的直徑為0.8 cm,每個平板上打三個孔,1個接種10 μL的PHG、PHV(濃度均為6 mg/mL)為實驗組,1個接種10 μL無菌水為陰性對照和1個接種10 μL(1 mg/mL鏈霉素和1 mg/mL卡那霉素的混合液)為陽性對照,在37 ℃恒溫下培養24 h,觀察測量抑菌圈的大小。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 PHG、PHV的重金屬含量分析

PHG、PHV的As、Hg、Cr、Pb、Cd含量的檢測結果如表1所示,PHG、PHV的5項重金屬指標均符合《食品安全國家標準 食品中污染物限量》GB 2762-2017的限量要求,且PHG的各項重金屬含量均低于PHV,說明皺紋盤鮑腹足及內臟酶解液均適合作為食品級抗氧化肽的原料。

表2 PHG、PHV的主要成分含量測定Table 2 Content detection of main components of PHG,PHV

表1 PHG、PHV的重金屬含量檢測結果(mg/kg)Table 1 Results of determination ofheavy metals in PHG,PHV(mg/kg)

2.2 PHG、PHV的主要成分測定

PHG、PHV的主要成分含量測定結果如表2所示,均以干基計。PHG、PHV的多肽含量分別為81.17%、78.21%,其在四種成分中含量最高,說明PHG、PHV可作為制備抗氧化肽食品的多肽原料。

2.3 PHG、PHV體外抗氧化活性分析

2.3.1 還原力 還原力的強弱是根據多肽樣品在700 nm處的吸光度的大小來進行判斷的,在700 nm處的吸光值越大,多肽的還原力就越強,且多肽的抗氧化能力也越強。因此,多肽的還原力是指示多肽抗氧化活性的一個重要指標。由圖1可知,在0～12 mg/mL范圍內,隨著多肽濃度的增大,PHG、PHV的還原力越來越強,VC的還原力也越來越強直至穩定,這說明PHG、PHV和VC的還原力和其濃度是有一定量效關系的。盡管PHG、PHV的還原力隨著多肽濃度的增加變強,其還原力沒有VC強,但也具有一定的抗氧化作用,且在整個反應時期,PHG的還原力始終略高于PHV,當濃度為12 mg/mL時,二者的還原力最高,PHG的還原力達到0.993,PHV的還原力為0.759。根據線性回歸方程得出,PHG還原力的AC50值為7.74 mg/mL,PHV還原力的AC50值為7.25 mg/mL,VC還原力的AC50值為0.052 mg/mL。Zhou[17]等在對鮑足肌的研究時發現抗氧化肽的還原力AC50值為15 mg/mL,對比文獻研究,本實驗中的PHG、PHV具有較強的抗氧化活性。

圖1 不同濃度PHG、PHV的還原力Fig.1 Reduction force of PHG,PHV with different concentrations

2.3.2 DPPH·清除率 如圖2所示,PHG、PHV的DPPH·清除率隨濃度的增大而逐漸升高,但始終低于VC的DPPH·清除率。在0～8 mg/mL的濃度范圍內,PHG、PHV的DPPH·清除率的升高速度越來越快,當濃度為8 mg/mL時,PHG的DPPH·清除率為94.35%,PHV的DPPH·清除率為69.94%;在8～12 mg/mL濃度范圍內,二者對DPPH·清除率的升高速度變緩,當濃度為12 mg/mL時,PHG的DPPH·清除率為96.67%,PHV的DPPH·清除率為84.17%。PHG對于DPPH·的清除活性IC50值為3.11 mg/mL,PHV對于DPPH·的清除活性IC50為5.79 mg/mL,VC對于DPPH·的清除活性IC50為0.36 mg/mL，可見對DPPH·清除能力為VC>PHG>PHV,但PHG和PHV的清除能力也是較好的。周大勇[17]等采用木瓜蛋白酶水解鮑魚內臟得到的酶解液,檢測的抗氧化肽酶解液對DPPH·清除率的IC50值為4 mg/mL,比本實驗的PHV稍高,可能是由于兩者使用的酶解原料、工具酶及酶解條件有差異。

圖2 不同濃度PHG、PHV的DPPH·清除率Fig.2 DPPH· clearance of PHG,PHV with different concentrations

2.3.3 ·OH清除率 由圖3可以看出,在本實驗體系濃度范圍內,PHG、PHV對·OH均有不同的清除能力,隨著反應體系濃度的增大,其清除率也不斷增大,PHG的·OH清除率的IC50值為3.70 mg/mL,PHV的·OH清除率IC50值為4.46 mg/mL,VC的IC50值為0.77 mg/mL,三者的·OH清除率呈明顯的劑量依賴關系。在0～6 mg/mL濃度范圍內,PHG的·OH清除率高于PHV,在8～12 mg/mL范圍內,PHV的·OH清除率高于PHG,這可能是由于多肽的抗氧化活性與氨基酸的種類相關[13]。最終PHG、PHV的清除率分別達到72.66%、78.23%,二者對·OH的清除率逐漸穩定。

圖3 不同濃度PHG、PHV的·OH清除率Fig.3 ·OH clearance of PHG,PHV with different concentrations

圖4 不同濃度PHG、PHV的清除率PHV with different concentrations

2.3.5 脂質氧化抑制率 如圖5所示,在整個反應時期PHG、PHV的脂質氧化抑制率均呈現先逐漸升高至穩定的趨勢,在濃度增加到8 mg/mL時,PHG、PHV的脂質氧化抑制率開始逐漸趨于穩定,此時,PHG的脂質氧化抑制率為50.85%,PHV的脂質氧化抑制率為66.51%。游麗君[19]曾提出氨基酸中的共軛結構對維持抗氧化性的穩定性起了至關重要的作用,脂質過氧化的過程實質上是亞油酸生成共軛二烯的過程,當共軛二烯的生成量達到一定程度時,脂質氧化的抑制率便逐漸穩定,多肽的抗氧化性逐漸穩定。PHG的脂質氧化抑制率IC50值為7.41 mg/mL,PHV的脂質氧化抑制率IC50值為4.15 mg/mL,VC的脂質氧化抑制率IC50值為0.83 mg/mL,說明PHV對脂質氧化的抑制作用高于PHG。

圖5 不同濃度PHG、PHV的脂質氧化抑制率Fig.5 Inhibition rate of lipid oxidation of PHG,PHV with different concentrations

2.3.6 Fe2+螯合率 Fe2+在脂質的氧化過程中會起到催化作用,因此具有螯合金屬離子作用的物質可以間接地起到抗氧化作用,螯合能力的強弱也在一定程度上體現了抗氧化性能的強弱[10]。如圖6所示,在濃度達到2.0 mg/mL之前,PHG和PHV對Fe2+的螯合率迅速升高,且PHV對Fe2+的螯合率高于PHG;從濃度4.0 mg/mL起,PHG對Fe2+的螯合率始終高于PHV,直至12 mg/mL時,PHV對Fe2+的螯合率趨于穩定,達到85.97%,PHG對Fe2+的螯合率繼續升高,甚至高于VC對Fe2+的螯合率,達到94.47%。整個實驗過程中,PHG對Fe2+的螯合率IC50值為3.36 mg/mL,PHV對Fe2+的螯合率IC50值為3.58 mg/mL,VC對Fe2+的螯合率IC50值為0.80 mg/mL,這說明PHG、PHV都表現出較高的螯合鐵的能力。

圖6 不同濃度PHG、PHV的Fe2+螯合率Fig.6 Fe2+ chelation rate of PHG,PHV with different concentrations

2.4 PHG、PHV對細菌的抑制結果分析

PHG、PHV對大腸桿菌的抑制作用如圖7和表3所示,PHG、PHV的抑菌圈直徑均大于相應的陽性對照抑菌圈直徑,說明PHG、PHV對大腸桿菌都有良好的抑制作用。PHV的抑菌圈直徑明顯大于PHG,抑菌圈直徑為11.61 mm,PHG的抑菌直徑為8.62 mm,說明PHV的抑菌能力較PHG更高。丁利君等[20]在研究羅非魚蛋白酶解液螯合物的抑菌效果時提出,酶解液螯合物中肽分子可能和細菌細胞膜受體蛋白結合,改變細胞質膜的通透性,造成膜結構破壞,引起膜內水溶性物質大量滲出,從而導致細菌死亡。本實驗的研究對象PHG、PHV為皺紋盤鮑腹足、內臟的酶解液,其抑菌效果正是上述抑菌機理所致。

圖7 PHG、PHV的抑菌效果Fig.7 Antimicrobial effect of antioxidant peptidase hydrolysate注:-：為陰性對照蒸餾水;+：為1000 U/mL的鏈霉素和卡那霉素陽性對照。

抗氧化肽類別抑菌圈陽性對照陰性對照PHG8.628.06-PHV11.619.23-

3 結論