2015—2017年河南省豬德爾塔冠狀病毒S基因和N基因遺傳變異分析

董建國 饒丹 李迎曉

摘要：為了解河南地區豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）的遺傳變異情況，采用RT-PCR方法對2015—2017年采自河南省南部地區豬場疑似PDCoV豬腸道內容物中的S和N基因進行擴增和測序，并進行遺傳進化分析。結果表明，本次擴增基因間同源性較高，單獨成一支，且與我國分離的CH/Sichuan/S27/2012毒株、泰國分離的Swine/Thailand/S5011、美國近些年分離的毒株位于同一分支。近年我國大陸分離的其他毒株和我國香港早期分離的HKU15-44、HKU15-155均位于另一分支，故結果提示河南地區PDCoV發生了一定的變異，該研究結果為本地區PDCoV疫情的防控提供了一定的理論依據。

關鍵詞：豬德爾塔冠狀病毒;S基因;N基因;變異分析

中圖分類號： S852.65+1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0052-03

冠狀病毒能感染多種動物甚至人類，引起呼吸道和腸道疾病。冠狀病毒一般可分為α冠狀病毒、β冠狀病毒和γ冠狀病毒3個群，最近國際病毒分類委員會在原有基礎上增加了δ冠狀病毒群。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為α冠狀病毒，均能引起豬腹瀉、嘔吐甚至死亡。2009年，在豬腸道腹瀉樣品中，研究人員檢測出豬冠狀病毒，經鑒定為豬δ冠狀病毒（PDCov），屬于δ冠狀病毒群[1]。目前，由冠狀病毒引起的豬腸道疾病對我國的養豬業造成了重大損失。2009年，我國香港首次報道在豬腹瀉病料中檢測到2個豬δ冠狀病毒，命名為HKU 15-44和HKU 15-155[1]。2014年2月，美國俄亥俄州農業部宣布美國存在豬δ冠狀病毒。1個月后明尼蘇達大學首次全基因測序一株豬δ冠狀病毒SDVC/USA/Illinois121/2014[2]。此后不久，愛荷華州立大學做出了同樣的報道[3]。至2015年1月，美國至少20個州暴發豬δ冠狀病毒[4]。2014年4月，韓國出現豬δ冠狀病毒[5]。2015年，江西農業大學首次報道我國大陸出現豬δ冠狀病毒[6]。

近年來，豬腹瀉相關傳染病對我國的養豬業造成了重大損失。針對此次豬δ冠狀病毒的爆發，河南地區還未有相關分子流行病學調查。因此，本研究以豬δ冠狀病毒為研究對象，針對纖突蛋白（S）基因和核蛋白（N）基因進行分子流行病學調查，以掌握我國豬δ冠狀病毒的流行現狀，為豬δ冠狀病毒的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料

針對2015—2017年河南省駐馬店和信陽地區豬場疑似暴發豬德爾塔冠狀病毒的自然發病豬，采集發病豬腸道組織及腹瀉樣品于-80 ℃凍存備用，所有試驗均在信陽農林學院牧醫工程學院動物疾病檢測實驗室完成。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自Magen公司產品;反轉錄試劑盒，購于Promega公司產品;RT-PCR相關試劑盒，購自ToYoBo生物科技有限公司和Vazyme公司;DNA Marker DL 2000等，購自TaKaRa公司;EB替代染料，購自廣州華奇盛生物科技有限公司。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中發布的CH SXD12015等豬德爾塔冠狀病毒毒株全基因組序列進行生物信息學分析，根據S基因、M基因和N基因保守區域設計擴增其全長的特異性引物序列。引物由江蘇蘇州金維智生物公司合成。引物信息見表1。

1.4 S和N基因的擴增及克隆

將小腸內容物加入1 mL滅菌PBS混勻，按TRIzol試劑盒操作說明書提取病料組織總RNA。以提取的總RNA為模板，采用AMV反轉錄酶進行RNA反轉錄制備cDNA。然后以cDNA為模板，S1F/R、S2F/R、S3F/R、MF/R和NF/R為引物，使用TOYOBO生物科技有限公司高保真酶對目的片段進行擴增。擴增體系為50 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgSO4 3 μL，cDNA模板4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，RNase Free H2O 28 μL。PCR擴增循環條件：94 ℃ 預變性2 min;98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s/kb，擴增35個循環;72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR陽性樣品用凝膠回收后克隆于pEASY-Simple T1 Cloning Vector載體上，陽性重組質粒由江蘇蘇州金維智生物公司測序。

1.5 序列比對與分析

利用Lasergene及Mega 5.0軟件對不同病毒株的S基因和N基因序列構建進化樹，PDCov代表毒株的基因序列均下載自GenBank。

2 結果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測

采用S和N基因特異性引物擴增出S的3個片段S1、S2、S3和N基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析表明，擴增片段大小與預期一致，測序結果表明擴增片段是PDCov，編號分別為ZMD1、ZMD2、ZMD3、XY1、XY2，ZMD代表駐馬店地區，XY代表信陽地區（圖1、圖2、圖3、圖4）。

2.2 PDCoV S基因進化樹的構建

運用分子生物學軟件Mega 5.0對測定的S基因序列和國內外具有代表性的序列構建進化樹，結果（圖5）顯示，整個遺傳進化樹可分為兩大分支， 其中擴增的PDCoV S基因與我

國大陸毒株CH/Sichuan/S27/2012、我國臺灣毒株Swine/Thailand/S5011和美國毒株PDCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014處于同一分支Group Ⅰ，且擴增的S基因單獨形成一支。2015年我國分離的PDCoV毒株以及2004年分離的CHN/AH/2004、2014年分離的CHN/HB/2014和2009年我國香港分離的HKU15-44、HKU15-155處于同一分支Group Ⅱ。

2.3 PDCoV N基因進化樹的構建

運用分子生物學軟件Mega 5.0對測定的N基因序列和國內外具有代表性的序列構建進化樹，結果（圖6）顯示，整個遺傳進化樹可分為兩大分支，其中擴增的PDCoV N基因與我國大陸毒株CH Sichuan/S27/2012、我國臺灣毒株Swine/Thailand/S5011和美國毒株PDCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014處于同一分支Group Ⅰ，且擴增的N基因單獨形成一支。2015年中國分離的PDCoV毒株以及2004年分離的CHN/AH/2004、2014年分離的CHN/HB/2014和2009年香港分離的HKU15-44、HKU15-155處于同一分支Group Ⅱ。

3 討論

冠狀病毒能夠引起人、哺乳動物和禽類發病，對公共安全具有潛在威脅。δ冠狀病毒是冠狀病毒家族的新成員，于2009年首次在香港的野禽中被發現[7]。2014年2月美國在俄亥俄州發現首例PDCoV，隨后在20多州的豬群中發現PDCoV[4]。近幾年，我國多省份均有PDCoV的報道[8]。筆者所在實驗室從2015年9月起對來自河南省不同地區的腹瀉病料樣品進行PDCoV檢測，共檢測出5份陽性。

PDCoV基因組全長約25 kb，依次編碼3個結構蛋白：纖突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）[2-3]。PDCoV具有冠狀病毒的一般特性，S蛋白在病毒和宿主結合和產生中和抗體等方面起著重要的作用，是冠狀病毒主要的抗原蛋白和新型疫苗研究的首選蛋白[8]。N蛋白是冠狀病毒的核衣殼蛋白，在細胞因子產生方面發揮作用。根據S蛋白和N蛋白的進化樹分析可知，本次擴增的基因之間同源性較高，單獨成一支，且與我國大陸分離的CH/Sichuan/S27/2012毒株和我國臺灣、美國近些年分離的毒株位于同一分支。與近些年中國分離的其他毒株不在一個分支，這些結果表明河南地區PDCoV發生了一定的變異。

PDCoV與另外2個豬冠狀病毒PEDV[9]和TGEV一樣，均能引起豬腸道疾病。研究表明，PDCoV感染仔豬后，能夠引起仔豬嚴重腹瀉、嘔吐、脫水和明顯的腸道病變，致死率高達40%[10]。與PEDV不同的是，PDCoV不僅感染腸道，還能夠感染肺臟、腎臟和肝臟等多個器官，并引起相應器官不同程度的病變，說明豬PDCoV比PEDV有更高的組織嗜性，并且，PDCoV和PEDV之間沒有交叉免疫反應。因此，研制有效的疫苗用于該病的防控是急需解決的問題。目前還沒有針對PDCoV的商品化疫苗與診斷試劑。隨著研究的深入，相信不久的將來，會有效果很好的PDCoV疫苗和診斷試劑用于控制該病的發生與流行。

參考文獻：

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[10]Chen Q，Gauger P，Stafne M，et al. Pathogenicity and pathogenesis of a United States porcine Deltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old[J]. Virology，2015，482：51-59.