基于近紅外光譜分析技術(shù)的轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本快速鑒別方法

林萍 高明清 陳永明

摘要：提出一種利用近紅外光譜技術(shù)快速鑒別轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本的新方法，采用近紅外光譜儀獲取轉(zhuǎn)Bt基因的水稻種子克螟稻1號、克螟稻2號及其親本秀水11的反射光譜特征曲線，采用ISOMAP流形降維法對采集到的光譜數(shù)據(jù)進行非線性降維，提取45個特征波長，用于建模輸入，利用最小二乘支持向量機方法建立光譜反射率值與類別值之間的預測模型。3種水稻種子樣本數(shù)均為350個，共計1 050個樣本，將其分成900個訓練集樣本和150個預測集樣本，預測準確率達94.67%。說明本研究提出的方法對于轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本具有很好的分類和鑒別能力，且檢測過程比傳統(tǒng)理化檢測手段簡單，操作性強。該研究為今后轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的快速無損檢測提供了新的方法。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;ISOMAP流形降維;最小二乘支持向量機;近紅外光譜技術(shù)

中圖分類號： O657.33;S127 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0072-03

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應用，它在提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、增強農(nóng)作物的抗逆性和抗蟲等方面成績顯著，越來越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品開始出現(xiàn)在人們的餐桌上。中國是產(chǎn)糧大國，水稻產(chǎn)量居全球首位，但有75%的水稻受水稻螟蟲蟲害，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)，種植Bt水稻可以減少80%的殺蟲劑用量，并且給農(nóng)戶帶來40億美元/年的收益[1-2]。目前，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)也逐漸受到研究人員關(guān)注，綜合各國現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法，主要有DNA檢測法和蛋白質(zhì)檢測法兩大類[3]，常用的包括核氣相質(zhì)譜法[4]、酸印記法（southern blot）[5]、酶聯(lián)免疫吸附法、聚合酶鏈式反應、蛋白質(zhì)印記法[6]等，各檢測方法的特點如表1所示。這些化學分析法由于耗時長、操作復雜、易造成環(huán)境污染，難以滿足實際應用中在線快速準確鑒別的需要。因此，尋求一種高效、快速、準確的檢測方法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的鑒定識別顯得尤為重要。

目前，近紅外光譜分析技術(shù)已經(jīng)開始應用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測應用研究中。芮玉奎等利用近紅外光譜分析技術(shù)分析了3 500～12 000 cm-1區(qū)間的波譜信息，對轉(zhuǎn)基因玉米及其親本進行了識別分析，得到了很高的識別精度[7]。Hu等利用近紅外透射光譜數(shù)據(jù)建立了轉(zhuǎn)基因白楊樹的識別模型，結(jié)果證明該方法可以有效地識別轉(zhuǎn)基因樹木[8]。愛荷華州立大學谷物品質(zhì)研究室利用傳統(tǒng)種植大豆和Roundup Ready大豆的近紅外光譜在910～1 000 nm波長附近的1個偏移，成功地將傳統(tǒng)種植大豆和抗草甘膦大豆有效地區(qū)分開來[9]。翟亞鋒等利用近紅外光譜分析技術(shù)對轉(zhuǎn)基因小麥種子進行判別分析，得到了滿意的效果[10]。朱文超等利用近紅外光譜實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因水稻及其親本葉片的判別[11]，但針對轉(zhuǎn)基因水稻種子方面的報道較少，且在國內(nèi)外文獻中鮮有對轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本光的近紅外光譜特性進行研究的報道。

本研究的目的是通過近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代化學計量學方法實現(xiàn)對轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子克螟稻1號和克螟稻2號及其親本秀水11的快速無損檢測。

1 試驗與方法

1.1 儀器設(shè)備

試驗數(shù)據(jù)的獲取采用美國ASD（Analytical Spectral Device，Boulder，USA）公司的Handheld Field Spec光譜儀，光譜分辨率為0.002 μm，光源采用14.5 V鹵素燈，采集系統(tǒng)原理如圖1所示。因為轉(zhuǎn)Bt基因的水稻是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白基因作為外源基因?qū)胨精@得的，因此試驗采集1.000～2.650 μm中紅外波段的漫反射光譜總計共1 050個樣本，每個樣本光譜掃描次數(shù)設(shè)定為30次并取平均值。選取900個樣本作為建模集樣本進行訓練，剩余150個作為預測集樣本，分析軟件采用Matlab R2016a（The Math Works，USA）。

1.2 樣品與數(shù)據(jù)采集

樣本均來自浙江大學水稻生物學國家重點實驗室，依次做好標記并放入保鮮袋中，置于0 ℃氣候箱中保存。共計 1 050 個樣本，其中轉(zhuǎn)Bt基因水稻克螟稻1號和克螟稻2號以及親本秀水11樣本分別為350個。光譜數(shù)據(jù)采集和分析試驗于2016年8月在原農(nóng)業(yè)部光譜檢測重點實驗室進行，不同品種樣本的光譜采集采用交替進行的方式，每個樣本采集數(shù)據(jù)30次作平均處理并保存，所有測量都在相同的條件下進行，溫度28 ℃，相對濕度65%。

1.3 流形降維法

由于近紅外光譜主要是倍頻和合頻的吸收，光譜信息重疊嚴重，用光譜技術(shù)精確定量樣本的特征屬性首先須要從復雜的光譜信息中提取出有用信息。本研究利用降維技術(shù)將高光譜數(shù)據(jù)投影到低維空間中，從而更有利于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的聚類性質(zhì)[12]。目前常用的降維技術(shù)有主成分分析、多維尺度變換[13]等。這些方法多是基于線性降維技術(shù)，難以有效表達非線性高維數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，它們構(gòu)造的歐式距離矩陣不能有效地將流形樣本點間的非線性關(guān)系反映出來，無法求解高維非線性數(shù)據(jù)集的本質(zhì)維數(shù)。等距映射（ISOMAP）[14]是一種新的非線性降維技術(shù)，該方法采用標準多維尺度變換算法獲得樣本間測地距離不變的低維流型，它從樣本局部空間出發(fā)，在保持數(shù)據(jù)點的內(nèi)在幾何性質(zhì)（兩點間的測地距離）不變的基礎(chǔ)上，使用最近鄰圖中的最短路徑作為測地線距離，并作為多維尺度變換地輸入，進而發(fā)現(xiàn)嵌入在高維空間的低維坐標。

1.4 最小二乘支持向量機

最小二乘支持向量機算法是在經(jīng)典支持向量機算法的基礎(chǔ)上改進得到的，與傳統(tǒng)支持向量機不同的是最小二乘支持向量機算法只要求解一個線性方程組，相比于傳統(tǒng)支持向量機（SVM）算法須要求解非線性方程組而言要簡單得多[15]。本研究采用徑向基（RBF）核函數(shù)作為非線性函數(shù)，其參數(shù)的選擇采用格點搜索法和留一交叉驗證法對校正集樣本進行訓練，得到最佳參數(shù)γ和δ2值。γ值對改進最小二乘支持向量機模型起至關(guān)重要的作用，決定結(jié)構(gòu)風險最小化（SRM）和經(jīng)驗風險最小化（ERM）之間的平衡。δ2直接影響初始的特征值和特征向量，用于控制函數(shù)回歸誤差，δ2值過小，易出現(xiàn)對樣本數(shù)據(jù)的過學習現(xiàn)象，反之則只出現(xiàn)欠學習現(xiàn)象。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的近紅外光譜圖

由于測量到的光譜在1 000～1 100 nm范圍內(nèi)存在較大的噪聲，因此選用1 100～2 500 nm波長范圍內(nèi)共計1 400個變量進行分析。轉(zhuǎn)Bt基因的水稻種子及其親本的近紅外吸收光譜如圖2所示，圖中橫坐標為波長，縱坐標為反射率。從圖2可以看出，3種水稻種子的光譜曲線趨勢非常相似，只從光譜特征上難以區(qū)分不同種類的轉(zhuǎn)基因水稻種子。因此，須要運用相應的化學計量學建模方法對光譜數(shù)據(jù)進行處理。

2.2 非線性特性檢測

本研究采用2種定量的數(shù)值統(tǒng)計方法（Durbin-Watson測試法[16-17]、Run測試法[18]）來檢查光譜數(shù)據(jù)的非線性程度。經(jīng)計算，Durbin-Watson測試值d為1.548，大于臨界值 dH=1.40，表明模型殘差不相關(guān)存在非線性結(jié)構(gòu)，Run測試法的檢驗值Z為2.316，大于臨界值1.96。試驗結(jié)果表明，采集到的光譜數(shù)據(jù)存在顯著的非線性結(jié)構(gòu)。此外，增強偏殘差圖分析法[19]也用來確定采集到的光譜數(shù)據(jù)中是否存在非線性結(jié)構(gòu)。圖3為第1主成分（PC1）與前6個主成分殘差多項式擬合的結(jié)果，由此可以看出數(shù)據(jù)集存在顯著的非線性結(jié)構(gòu)。

2.3 線性與非線性降維方法比較

圖4是分別采用線性降維方法PCA、多維尺度變換以及非線性降維方法ISOMAP提取的特征波長，結(jié)合最小二乘支持向量機回歸分析方法得到的建模集樣本的預測精度與本真維數(shù)之間的關(guān)系曲線。使用ISOMAP算法進行降維時有2個參數(shù)須要調(diào)整，分別是鄰域參數(shù)k和樣本本真維數(shù)d。在不同參數(shù)組合下，基于ISOMAP的最小二乘支持向量機模型得到不同的預測效果。本研究參數(shù)優(yōu)化采用網(wǎng)格搜索法和留一法驗證法，對光譜數(shù)據(jù)建模集分別選取k∈[5，20]、d∈[5，100]作ISOMAP降維，再用最小二乘支持向量機進行回歸建立轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的校正模型。從圖4可以看出，利用非線性流形降維方法ISOMAP提取的特征波長進行回歸預測得到的精度比線性降維方法PCA和多維尺度變換高。采用ISOMAP非線性流形降維方法預測精度隨著維數(shù)的增加逐漸提高，當鄰域參數(shù)k=5、本真維數(shù)d=45時，預測精度達到最高，為94.67%。2種線性降維方法PCA和多維尺度變換提取的特征波長進行回歸預測的效果相差不大，最高預測精度分別為75.31%和78.62%，對應的特征波長維數(shù)分別為40和60。通過比較分析可得，非線性降維方法能夠更好地發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的聚類性質(zhì)，揭示實際數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)。

2.4 最小二乘支持向量機建模及預測

本研究采用了二步格點搜索法對參數(shù)γ和δ2進行優(yōu)化，參數(shù)γ的選擇范圍設(shè)定為2-1～210，δ設(shè)定為2～215。尋優(yōu)過程由粗選和精選2個步驟組成：粗選搜索步長較大，最優(yōu)參數(shù)范圍由誤差等高線確立;精選在粗選基礎(chǔ)上，采用較小步長進行搜索，最終確定最優(yōu)模型參數(shù)，尋優(yōu)結(jié)果得到最優(yōu)的γ和δ2分別為43.598和11.368。為了評估最小二乘支持向量機模型鑒別轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的魯棒性，計算了預測結(jié)果的混淆矩陣和精度-召回曲線。從圖5-a可以看出，最小

二乘支持向量機回歸模型對克螟稻2號和秀水11的分類精度達到了100%，所有的樣本都被正確判別出。克螟稻1號有16%被誤判為秀水11。圖5-b是精度-召回曲線，平均準確率是計算所有精度-召回曲線上的單點局部值的平均準確度，考慮了樣本總體分類效果，計算得到MAP指數(shù)為 0.97。分類結(jié)果說明近紅外光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的無損、快速檢測。

3 結(jié)論

利用近紅外光譜技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本進行了判別研究。根據(jù)Durbin-Watson測試法和Run測試法檢查光譜數(shù)據(jù)的非線性程度，檢測結(jié)果表明，光譜數(shù)據(jù)中存在非線性結(jié)構(gòu)， 因此須要進一步采用非線性流形降維ISOMAP法對近紅外光譜數(shù)據(jù)進行降維，來獲取有效光譜信息，將ISOMAP提取的本真光譜結(jié)構(gòu)作為最小二乘支持向量機的輸入實現(xiàn)近紅外光譜的非線性建模，達到總體識別精度為 94.67%，平均準確率指數(shù)為0.97，提出的檢測方法比常規(guī)的化學方法簡單、操作性強。本研究為流形學習算法引入近紅外光譜建模提供了一種有益嘗試，為今后轉(zhuǎn)基因水稻種子的快速無損檢測提供了新的方法。

參考文獻：

[1]俞 超，張 吉，葉生晅，等. Bt轉(zhuǎn)基因水稻生理生化特性研究初報[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2008（4）：31-33.

[2]劉 凱，楊亞軍，田俊策，等. 不同氮肥水平下轉(zhuǎn)Bt基因水稻對褐飛虱和白背飛虱生態(tài)適應性的繼代影響[J]. 中國水稻科學，2016，30（2）：200-209.

[3]謝小波，舒慶堯. 用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac試劑盒快速測定轉(zhuǎn)基因水稻Bt殺蟲蛋白含量的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，2001，34（5）：465-468.

[4]Fiehn O，Kopka J，Trethewey R N，et al. Identification of uncommon plant metabolites based on calculation of elemental compositions using gas chromatography and quadrupole mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry，2000，72（15）：3573-3580.

[5]Milcamps A，Rabe S，Cade R，et al. Validity assessment of the detection method of maize event Bt10 through investigation of its molecular structure[J]. Journal of Agricultural&Food Chemistry，2009，57（8）：3156-3163.

[6]Margarit E，Reggiardo M I，Vallejos R H，et al. Detection of Bt transgenic maize in foodstuffs[J]. Food Research International，2006，39（2）：250-255.

[7]芮玉奎，羅云波，黃昆侖，等. 近紅外光譜在轉(zhuǎn)基因玉米檢測識別中的應用[J]. 光譜學與光譜分析，2005，25（10）：1581-1583.

[8]Hu Z，Yeh T F，Chang H，et al. Elucidation of the structure of cellulolytic enzyme lignin[J]. Holzforschung，2006，50（4）：1040-1397.

[9]Zhou P P，Zhou R，Zhao Y F，et al. Contamination assessment of dietary ethyl carbamate in wine[J]. Chinese Journal of Food Hygiene，2008，20（3）：208-209.

[10]翟亞鋒，蘇 謙，鄔文錦，等. 基于仿生模式識別和近紅外光譜的轉(zhuǎn)基因小麥快速鑒別方法[J]. 光譜學與光譜分析，2010，30（4）：924-928.

[11]朱文超，成 芳. 轉(zhuǎn)基因水稻及其親本葉片的可見/近紅外光譜分析[J]. 光譜學與光譜分析，2012，32（2）：370-373.

[12]翁時鋒，張長水，張學工. 非線性降維在高維醫(yī)學數(shù)據(jù)處理中的應用[J]. 清華大學學報（自然科學版），2004，44（4）：485-488.

[13]吳曉婷，閆德勤. 數(shù)據(jù)降維方法分析與研究[J]. 計算機應用研究，2009，26（8）：2832-2835.

[14]汪洪橋，蔡艷寧，孫富春，等. 多尺度核方法的自適應序列學習及應用[J]. 模式識別與人工智能，2011，24（1）：72-81.

[15]楊國強，張淑娟，趙艷茹. 基于近紅外透射光譜的汾陽王酒快速鑒別[J]. 農(nóng)業(yè)機械學報，2013，44（增刊1）：189-193.

[16]Capron X，Walczak B，Noord O D，et al. Selection and weighting of samples in multivariate regression model updating[J]. Chemometrics&Intelligent Laboratory Systems，2005，76（2）：205-214.

[17]Kleinbaum D G，Kupper L L，Muller K E. Applied regression analysis and other multivariate models[J]. Technometrics，1978，31（1）：117-118.

[18]Walczak B，Jouanrimbaud D，Massart D L，et al. Comparison of multivariate calibration techniques applied to experimental NIR data sets[J]. Applied Spectroscopy，2000，54（4）：608.

[19]Kompany-Zareh M，Mirzaei S. Spectrophotometric resolution of ternary mixtures of pseudoephedrine hydrochloride，dextromethorphan hydrobromide，and sodium benzoate in syrups using wavelength selection by net analyte signals calculated with hybrid linear analysis[J]. Analytica Chimica Acta，2004，526（1）：83-94.