混合鹽脅迫下植物促生菌對(duì)高粱種子萌發(fā)的促生效應(yīng)

王倩倩 張麗輝 趙驥民

摘要：由鹽生植物根際土中分離得到含ACC脫氨酶的PGPR（植物根際促生菌）嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），研究其在中性鹽與堿性鹽條件下對(duì)高粱種子萌發(fā)的促生效應(yīng)。結(jié)果表明，從30、60、90、120 mmol/L的鹽堿脅迫處理?xiàng)l件下，PGPR處理對(duì)高粱種子在各項(xiàng)萌發(fā)參數(shù)上均有顯著促生效果。其中接菌的高粱種子的胚芽、胚根比未接菌的要長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)更好;接菌的比不接菌的根冠比高，說明促生菌在一定程度上促進(jìn)了植株根部的營(yíng)養(yǎng)吸收。據(jù)此可推測(cè)，含ACC脫氨酶的植物促生菌可緩解混合鹽脅迫（中性鹽與堿性鹽）對(duì)高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，從而促進(jìn)高粱種子的萌發(fā)力。

關(guān)鍵詞：植物促生菌;中性鹽脅迫;堿性鹽脅迫;高粱種子萌發(fā);促生效應(yīng)

中圖分類號(hào)： S514.01;Q945.78 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）13-0091-04

現(xiàn)如今，由于全球氣候變化，人口不斷增長(zhǎng)，工業(yè)化急劇發(fā)展，環(huán)境污染逐漸升級(jí)等各種因素的影響，導(dǎo)致了土壤鹽堿化程度日益加重。在我國(guó)，東北地區(qū)的松嫩平原鹽堿化土地面積達(dá)373.3萬hm2，而且土壤鹽分組成非常復(fù)雜，既含有NaHCO3、Na2CO3等堿性鹽，又含有NaCl、Na2SO4等中性鹽[1]。目前國(guó)內(nèi)外主要集中在NaCl對(duì)植物毒害的研究，很少有研究不同鹽類混合而引起的混合鹽脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的傷害[2]。

植物促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治病害、增加作物產(chǎn)量的微生物[3-4]。PGPR對(duì)土壤中有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物（deleterious rizosphere microorganisms，簡(jiǎn)稱DRMO）都有一定的生防作用，而且對(duì)植物吸收利用礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)也有促進(jìn)作用，并可以產(chǎn)生有益植物生長(zhǎng)的代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[5-6]。近年來已有很多學(xué)者研究表明，植物生長(zhǎng)促生菌可以間接通過產(chǎn)生抗生素和分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對(duì)植物產(chǎn)生的不良影響，還能通過解磷、固氮、產(chǎn)生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)[7-8]。許多植物根際促生菌可以產(chǎn)生吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、維生素（antibiotic）等，以及利用并降解植物產(chǎn)生的乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）），使ACC分解成A-丁酮酸和氨，從而降低了逆境條件下植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的乙烯，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[9-10]。所以植物生長(zhǎng)促生菌，特別是含ACC脫氨酶的植物促生菌備受各界關(guān)注，尤其被認(rèn)為在逆境條件下能有效促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

如今，國(guó)內(nèi)外已有越來越多的專家學(xué)者從事植物促生菌的研究，大量實(shí)踐證明通過接種含ACC脫氨酶的植物生長(zhǎng)促生菌，能夠大大提高植物的抗逆性[11-13]。含ACC脫氨酶的PGPR的主要作用機(jī)制是通過降低逆境乙烯的濃度，促進(jìn)植物根的伸長(zhǎng)，提高植物的抗逆性。故本研究參考Penrose等的研究，采取定向富集分離方法，并只挑取占競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的菌落，篩選出含ACC脫氨酶的PGPR。又根據(jù)東北地區(qū)的現(xiàn)狀，采用高粱這種耐鹽植物作為研究對(duì)象，再通過種子萌發(fā)試驗(yàn)來決速評(píng)價(jià)PGPR的促生性能，得出PGPR對(duì)不同鹽堿濃度下高粱的萌發(fā)期表現(xiàn)出來的一系列積極影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：以ACC為唯一氮源，從生長(zhǎng)于高pH鹽堿脅迫下的白城地區(qū)燕麥根際土中自行篩選分離得到的PGPR菌株。經(jīng)16S rDNA序列分析，初步確定此種促生菌為嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。

供試植物：高粱吉雜83，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種研究所1993年以不育系“352A”為母本，恢復(fù)系“116-2-5”為父本雜交育成。1999年經(jīng)吉林省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定通過。屬中早熟品種，出苗至成熟118 d左右，需≥10 ℃積溫2 400～2 500 ℃。抗旱、抗倒、耐密植，抗葉病，抗蚜蟲，高抗絲黑穗病。適宜在吉林省的長(zhǎng)春、松原、白城地區(qū)及熬雜1號(hào)的栽培區(qū)種植。

培養(yǎng)基：TSB、DF等培養(yǎng)液按文獻(xiàn)[14]配方配制。

1.2 材料處理

種子消毒：將吉雜83高粱種子用自來水清洗3遍，在 0.1% HgCl2中消毒3 min，之后用無菌水洗滌5次。

菌懸液制備：供試菌株在TSB培養(yǎng)液中室溫（21±1） ℃過夜振蕩培養(yǎng)，4 ℃離心收集，菌體細(xì)胞用無菌0.03 mol/L MgSO4溶液洗滌，重新懸浮于無菌0.03 mol/L MgSO4溶液制成菌懸液（D600 nm=0.5±0.02）浸種用。

1.3 方法

室溫下將消過毒的高粱種子分為2份。一份浸于 0.03 mol/L MgSO4菌懸液（D600 nm=0.5±0.02），一份浸于無菌0.03 mol/L MgSO4溶液中1 h后，放于標(biāo)記好的培養(yǎng)皿中。

利用2種中性鹽氯化鈉和硫酸鈉（物質(zhì)的量之比9 ∶ 1）模擬鹽脅迫，利用2種堿性鹽碳酸氫鈉和碳酸鈉（物質(zhì)的量之比9 ∶ 1）模擬堿脅迫，每種脅迫設(shè)置4個(gè)梯度，每個(gè)梯度5次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50粒高梁種子放在3層濾紙的培養(yǎng)皿中。鹽堿脅迫設(shè)置的4個(gè)濃度梯度為30、60、90、120 mmol/L。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃/15 ℃，光照14 h/d。每天記錄正常發(fā)芽的種子個(gè)數(shù)以計(jì)算發(fā)芽率和發(fā)芽速率，以胚根露出種皮作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)。連續(xù)3 d發(fā)芽數(shù)不再變化，用刻度尺測(cè)量胚根和胚芽長(zhǎng)度將未萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到蒸餾水中，進(jìn)行復(fù)萌試驗(yàn)，每天記錄發(fā)芽數(shù)。試驗(yàn)結(jié)束計(jì)算相對(duì)發(fā)芽率、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)、相對(duì)發(fā)芽活力指數(shù)、相對(duì)生長(zhǎng)指標(biāo)。

在發(fā)芽試驗(yàn)的最后一天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽個(gè)數(shù)，每皿隨機(jī)測(cè)量10個(gè)幼苗的胚芽長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)，精確到0.01 cm。

2 結(jié)果與分析

2.1 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)中性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響

2.1.1 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)中性鹽脅迫下高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)與集中度的影響 由圖1可以看出，隨著中性鹽脅迫濃度的升高，高粱種子的發(fā)芽情況呈逐漸降低趨勢(shì)。但同一濃度梯度鹽脅迫下，接菌的高粱種子的相對(duì)發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、集中度都比未接菌的對(duì)照有顯著提高（P<0.05）。在鹽濃度達(dá)到120 mmol/L的時(shí)候，未接菌發(fā)芽率為67.33%，發(fā)芽勢(shì)為67.33%，集中度為60.67%，而接菌后高粱種子要高于未接菌的指標(biāo)，發(fā)芽率為73.33%，發(fā)芽勢(shì)73.33%，集中度70.00%。并且由7 d后高粱發(fā)芽照片也可以看出接菌的高粱種子的胚芽、胚根比未接菌的要長(zhǎng)，長(zhǎng)勢(shì)更好。據(jù)此可推測(cè)，含ACC脫氨酶的PGPR可一定程度上提高高粱種子的萌發(fā)率。

2.1.2 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)中性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)指數(shù)與活力指數(shù)的影響 種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)可以比發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)更靈敏地表現(xiàn)出種子活力，可以比較全面地

反映植物種子與環(huán)境的作用結(jié)果，發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)越高，說明發(fā)芽所用時(shí)間越短，長(zhǎng)勢(shì)越好。如圖2可見，在鹽濃度逐漸上升的情況下，種子的發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)都呈遞減，且除鹽脅迫30 mmol/L濃度外接菌處理后的高粱種子都要顯著高于對(duì)照的萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)（P<0.05）。在鹽脅迫60、90、120 mmol/L時(shí)，接種PGPR的萌發(fā)指數(shù)比不接菌顯著高 5.39%（P<0.01）、3.11%（P<0.05）、3.61%（P<0.01）;接菌的活力指數(shù)比不接菌分別高了40.56%（P<0.01）、5.55%（P<0.05）、18.37%（P<0.01）。從以上數(shù)據(jù)可推測(cè)含ACC脫氨酶的PGPR在一定程度上提高了高粱種子的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，與最終發(fā)芽率觀察結(jié)果相吻合。

2.1.2 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)中性鹽脅迫下高粱種子根冠比與相對(duì)鹽害率的影響 相對(duì)鹽害率是表明植株受到鹽堿脅迫的程度。如圖3可見，中性鹽脅迫對(duì)高粱種子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，接菌后的高粱種子比對(duì)照對(duì)高粱傷害小的多（P<0.05）。根冠比是反映幼苗生長(zhǎng)狀況的一項(xiàng)指標(biāo)，一般生長(zhǎng)健壯的幼苗有較高的根冠比。中性鹽處理的高粱種子接菌的比不接菌的根冠比高，說明促生菌在一定程度上促進(jìn)了植株根部的營(yíng)養(yǎng)吸收。

2.2 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)堿性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響

2.2.1 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)堿性鹽脅迫下高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)與集中度的影響 由圖4可見，從30～120 mmol/L 的堿脅迫濃度條件下，高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、集中度整體要低于鹽脅迫，且接菌的要整體稍高于未接菌的。在試驗(yàn)最高濃度堿脅迫處理（120 mmol/L）尤其明顯，未接菌的發(fā)芽率為73.33%、發(fā)芽勢(shì)為66.00%、集中度為57.33%，而接菌處理后的發(fā)芽率為82.00%、發(fā)芽勢(shì)為70.67%、集中度為63.33%。同濃度堿脅迫接菌可以在很小程度上促進(jìn)高粱的萌發(fā)，因此說明，堿脅迫對(duì)高粱的萌發(fā)傷害作用要高于鹽脅迫的影響，盡管隨著混合鹽堿的濃度升高，延緩了發(fā)芽時(shí)間，但最終發(fā)芽率仍維持較高的水平，這一結(jié)果說明高粱是一種優(yōu)質(zhì)的作物。

2.2.2 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)堿性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)指數(shù)與活力指數(shù)的影響 由圖5看出，堿性鹽脅迫處理高粱種子均引起種子萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)降低，而且隨著堿脅迫濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。在低堿濃度下 30 mmol/L 接菌和不接菌處理高粱種子的萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)均不明顯，在濃度60～120 mmol/L，對(duì)高粱種子萌發(fā)的抑制作用明顯增大，當(dāng)濃度為120 mmol/L時(shí)，接菌處理的高粱種子比對(duì)照的萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)分別提高了3.74百分點(diǎn)和16.19百分點(diǎn)。由此看出，接菌處理后的高粱種子可緩解堿脅迫對(duì)其的傷害作用，萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)都有顯著提高。

2.2.3 含ACC脫氨酶的PGPR對(duì)堿性鹽脅迫下高粱種子根冠比與相對(duì)鹽害率的影響 隨著堿脅迫濃度的升高，高粱所受的毒害亦隨之增強(qiáng)，高粱種子的相對(duì)鹽害率隨之升高，同時(shí)

其根冠比由于抑制增強(qiáng)而降低（圖6）。當(dāng)處于低堿脅迫時(shí)（30 mmol/L）接菌處理和對(duì)照高粱的根冠比無顯著性差異，隨著堿濃度的上升，尤其在120 mmol/L時(shí)，接菌處理的高粱植株根冠比比對(duì)照提高了7.22百分點(diǎn)，且接菌處理后的相對(duì)鹽害率比對(duì)照降低了8.67百分點(diǎn)。從以上試驗(yàn)結(jié)果得出，含ACC脫氨酶的植物促生菌可緩解堿性鹽對(duì)高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，從而促進(jìn)高粱種子的萌發(fā)力。

3 討論

以ACC為唯一氮源，從白城地區(qū)鹽生植物根際土自行篩選出的菌株，經(jīng)過16S rDNA序列分析，鑒定得出為一種嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。經(jīng)無菌育種萌發(fā)試驗(yàn)研究表明，含ACC脫氨酶的PGPR均能不同程度地顯著緩解中性鹽和堿性鹽脅迫對(duì)高粱種子的影響，促進(jìn)植物生長(zhǎng);在無鹽脅迫情況下，對(duì)高粱種子生長(zhǎng)無顯著促進(jìn)作用。從30～120 mmol/L的堿性鹽脅迫處理?xiàng)l件下，高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、集中度整體要低于中性鹽脅迫，且接菌的要整體稍高于未接菌的指標(biāo)。在鹽濃度逐漸上升的情況下，種子的發(fā)芽指數(shù)與活力指數(shù)都呈遞減趨勢(shì)，且除鹽脅迫 30 mmol/L 濃度外接菌處理后的高粱種子都要明顯高于對(duì)照的萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)（P<0.05）。隨著脅迫濃度的升高，堿性鹽比中性鹽對(duì)高粱的毒害更強(qiáng)，相對(duì)鹽害率更高，PGPR處理的高粱種子比沒有處理的根冠比高，說明促生菌在一定程度上促進(jìn)了植株根部的營(yíng)養(yǎng)吸收。從以上試驗(yàn)結(jié)果得出，含ACC脫氨酶的SM菌株可緩解中性鹽和堿性鹽對(duì)高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，從而促進(jìn)高粱種子的萌發(fā)力。

總之，通過人工模擬試驗(yàn)在混合性復(fù)雜鹽堿脅迫下，含ACC脫氨酶的S. maltophilia菌株浸種高粱后可以在一定程度上促進(jìn)高粱植株根長(zhǎng)、芽長(zhǎng)等途徑使植株獲得更多養(yǎng)料，以改善植株生長(zhǎng)狀況、改善植物所處的不良環(huán)境。但本試驗(yàn)未全面考慮植物促生菌在不同植物根際的定殖能力和利用生物修復(fù)土壤的有機(jī)結(jié)合，還需進(jìn)一步在野外進(jìn)行苗期的研究。

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