新型植物源農藥細辛精油乳油的研制

劉南南 王桂清

摘要：為明確細辛精油乳油制劑中有機溶劑、乳化劑的理想種類和乳油的最佳配方及配制技術，以細辛精油為原料，通過溶解度試驗、親水親油值（HLB）測定、穩定性試驗和生物活性測定法，證明N-甲基吡咯烷酮和植物油乳化劑是細辛精油的理想有機溶劑和乳化劑，細辛精油乳油的配方為以1 000 mL計，其中，細辛精油250 mL，N-甲基吡咯烷酮675 mL，植物油乳化劑75 mL，制備特征是先將植物油乳化劑與N-甲基吡咯烷酮按比例混合均勻，再加入細辛精油。該細辛精油乳油的研制成功，填補了國內尚無植物精油乳油制劑的空白，將滿足人們對綠色蔬菜和有機蔬菜的需求。

關鍵詞：細辛精油;N-甲基吡咯烷酮;植物油乳化劑;乳油;植物源農藥

中圖分類號：S482.3+9 ??文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0114-05

生物防治技術與產品已成為全球新型產業之一，具有廣闊前景。截至2016年底，我國生物農藥有效成分登記超過90種，登記產品約3 000個，生物防治技術及產品在農業有害生物防控中份額已超過15%。遼細辛[北細辛，Asarum heterotropoides F. Schmidt var. mandshuricum（Maxim）Kitag.]為馬兜鈴科（Aristolochiaceae）細辛屬（Asarum Linn.）植物，是我國重要的中草藥，精油是其主要的活性成分。細辛精油具有很高的生物活性，殺蟲抑菌譜廣泛，作用方式多樣，靶標位點豐富，具備研制開發成新型植物源農藥的潛質[1-9]。本研究以細辛精油為材料，探討其乳油制劑的配制方法，優化其配方，為將其推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌種與培養 黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）由聊城大學農學院植物病理實驗室提供，該真菌經馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板培養基、（25±1） ℃恒溫培養箱中培養5 d，備用。

1.1.2 試劑及配制 原藥：遼細辛精油，超臨界CO2法提取。 ?有機溶劑：二甲基亞砜，天津匯英化學試劑有限公司生產，含量≥99.00%;乙酸乙酯，萊陽經濟技術開發區精細化工廠生產，含量≥99.50%;無水乙醇，天津市登科化學試劑有限公司生產，含量≥99.70%;石油醚，天津市登科化學試劑有限公司生產，含量≥94.78%;N-甲基吡咯烷酮，天津市大茂化學試劑廠生產，含量≥99.00%;以上溶劑均為分析純。

乳化劑：植物油乳化劑（EL），聊城大學實驗室生產;乳化劑601，宜興市雙利化工有限公司生產;乳化劑602，杭州市電化集團助劑化工有限公司生產;吐溫-80，鄭州化工試劑廠生產，含量≥97.00%;By-140，南京太化化工有限公司生產。

以上試劑無菌水配制終濃度為62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 mg/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 抑菌試驗 采用生長速率法[10]測定乳化劑、有機溶劑、混劑、乳油等對黃瓜灰霉病菌的抑制作用。制含藥培養基，菌餅直徑0.5 cm，每皿1塊，3次重復，（25±1） ℃光照培養。待對照菌落直徑達3 cm以上時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制生長率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100%。

1.2.2 溶解度測定 根據2010版藥典[11]測定細辛精油在5種有機溶劑中的溶解度。若10 mL溶劑不能使1 mL細辛精油完全溶解，則該溶劑不適合配制乳油制劑，棄去。如果在某一溶劑中完全溶解時，則將其混合液放入0 ℃冰箱觀察分層和沉淀產生情況。根據下式計算溶解度，根據溶解度大小，篩選出合適的單一溶劑。

溶解度=精油的體積（mL）/所用溶劑的體積 （mL）×100%。

1.2.3 分散性測定 參考吳學民等的方法[12]測定“1.1.2”節5種單一乳化劑的分散性，以及N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑按不同比例（79 ∶ 1、39 ∶ 1、19 ∶ 1、9 ∶ 1、4 ∶ 1、1 ∶ 1）進行復配后混合物的分散性。

1.2.4 乳油配方篩選 根據有機溶劑和乳化劑的合適配比，將其與細辛精油按比例配制成乳油配方，進行抑菌試驗，選出增效最強的配制比例。

1.2.5 穩定性測定 標準穩定性測定：參照GB/T 1603—2001《農藥乳液穩定性測定方法》，將配好的0.5 mL乳油逐滴加入盛有100 mL 342 g/L標準硬水的具塞量筒中，上下顛倒30次后將量筒放到（30±2） ℃的水浴鍋中，靜止1 h后無浮油、浮膏和沉淀為合格。

低溫穩定性測定：參照GB/T 19137—2003《農藥低溫穩定性測定方法》，取80 mL配好的乳油置于100 mL燒杯中，0 ℃ 保持1 h，觀察有無固體或油狀物析出變化。繼續在（0±2） ℃的冰水浴中放置7 d，800 r/min離心15 min，計算沉淀物體積。

熱貯穩定性測定：參照GB/T 19136—2003《農藥熱貯穩定性測定方法》，將配好的乳油10 g密封于具塞試管中，3次重復，冷卻至室溫稱質量。將封好的樣品放到（54±2） ℃恒溫箱中放置14 d。取出，將外面擦凈后稱質量，質量未發生變化的試樣，于24 h內測定含量。以熱貯前測定的含量作為對照計算分解率，熱貯分解率≤5%為合格。

熱貯分解率=[（熱貯前含量-熱貯后含量）/熱貯前含量]×100%。

1.2.6 藥效對比試驗 供試試劑：細辛精油EC（乳油），4種農藥（2.0×109億孢子/g蠟質芽孢桿菌WP（可濕性粉劑）、0.3%苦參堿水劑、50%福美雙WP、10.3%霜霉立克EC（10%的霜氰唑和0.3%的丁子香酚）等。

供試靶標：黃瓜灰霉病菌。

試驗方法：生長速率法，同“1.2.1”節。

1.3 數據處理

試驗數據線性回歸由SPSS 13.0完成;差異顯著性分析依據Duncans新復極差法，由DPSv13.0專業版完成。并利用Wadley法[13]計算復配組合增效系數（SR），評價試劑復配增效影響因子。

2 結果與分析

2.1 有機溶劑的篩選

2.1.1 有機溶劑的溶解度測定 在實驗室測定了二甲基亞砜、石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、N-甲基吡咯烷酮等有機溶劑對細辛精油的溶解度，結果表明，二甲基亞砜和無水乙醇與細辛精油任意比互溶，且放置后無分層;乙酸乙酯和N-甲基吡咯烷酮與細辛精油1 ∶ 1溶解，溶解度為100%;而細辛精油在石油醚中難溶，搖動試管也不能完全溶解，放置一段時間后，出現明顯分層。

2.1.2 有機溶劑對黃瓜灰霉病菌的抑菌作用 在實驗室內，采用生長速率法測定了5種有機溶劑對黃瓜灰霉病菌的抑制作用，結果見表1。

從表1可以看出，N-甲基吡咯烷酮的抑制中濃度EC50較低，為292.09 mg/L，而其他4種有機溶劑的EC50均超過了550 mg/L，說明N-甲基吡咯烷酮的抑制效果較好，即N-甲基吡咯烷酮是較理想的有機溶劑。

2.2 乳化劑的篩選

2.2.1 乳化劑分散性的測定 植物油乳化劑、吐溫-80、乳化劑601、乳化劑602、By-140等5種乳化劑以及N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑混合試劑的分散性，結果見圖1。

從試驗觀察過程和圖1可以得出，單一乳化劑的分散性不同，5種供試乳化劑的分散性依次為植物油乳化劑>乳化劑601=乳化劑602>吐溫-80=By-140。植物油乳化劑逐滴加入即可分散溶解，乳化成乳白色液體，繼續觀察，溶液呈淡藍色熒光，分散性最好;乳化劑601和乳化劑602逐滴加入自動分散溶解，輕輕搖晃可呈霧狀散開，掛壁均勻，溶液透明，分散性較好;吐溫-80和By-140逐滴加入不會立刻分散溶解，輕輕搖動一段時間后分散溶解，溶液透明。分散性與乳化劑的親水親油（HLB）值有關，植物油乳化劑的HLB值為7～8，吐溫-80的為15，By-140為10～16，乳化劑601和乳化劑602為 12～16。相比較而言，植物油乳化劑的HLB值最小，說明植物油乳化劑的親油性較強，形成穩定的乳狀分散，所以分散性最好，而另外4種乳化劑的HLB值較大，親水性較好，形成透明溶液，所以分散性沒有那么好。

N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑按不同比例混合，逐滴加入水中，呈絲狀分散開，輕輕搖動，溶解分散。且隨著植物油乳化劑所占比例的增加，熒光藍加強，乳化效果加強，分散性增強。

2.2.2 乳化劑對黃瓜灰霉病菌的抑菌作用 在實驗室內，采用生長速率法測定了5種乳化劑對黃瓜灰霉病菌的抑制作用，在供試濃度下，植物油乳化劑、乳化劑601和乳化劑602等對黃瓜灰霉病菌表現出明顯的抑制作用，毒力效果見表2;而吐溫-80表現為促進作用，By-140表現為高濃度（≥500 mg/L）促進、低濃度（≤250 mg/L）抑制。因此吐溫-80和By-140對黃瓜灰霉病菌的毒力效果沒有計算。

2.3 有機溶劑和乳化劑的配比試驗

N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑混合對黃瓜灰霉病菌的抑制作用，結果見表3。

從表3可以看出，N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑比例為1 ∶ 1、4 ∶ 1、9 ∶ 1時，EC50較低，分別為34.11、68.54、171.22 mg/L，且增效系數分別為7.218 5、4.084 4和 1.713 2，表現為增效作用;但乳油制劑要求，乳化劑的占比為8%～10%，所以1 ∶ 1、4 ∶ 1這2個配比不適合用于乳油制劑。當比例為 19 ∶ 1、39 ∶ 1、79 ∶ 1時，EC50>760 mg/L，增效系數<0.4，表現出拮抗作用。說明N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑比例為9 ∶ 1時最為合適。

2.4 細辛精油乳油的配方篩選

在實驗室內，以N-甲基吡咯烷酮為有機溶劑、以植物油乳化劑為乳化劑配制細辛精油乳油，采用生長速率法測定細辛精油含量分別為25.0%和12.5%的乳油對黃瓜灰霉病菌的抑制作用，結果見表4。

由表4可見，當細辛精油含量為25.0%時的乳油對黃瓜灰霉病菌的抑制效果比較好，EC50均低于750 mg/L，而含12.5%細辛精油乳油對黃瓜灰霉病菌的抑制效果不理想，EC50高達3 409.66 mg/L，說明細辛精油含量為25.0%的乳油比較理想。比較細辛系數，當N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑比例為9 ∶ 1時，表現為相加作用，說明含25.0%細辛精油的N-甲基吡咯烷酮與植物油乳化劑比例為9 ∶ 1的乳油配比為最優。

2.5 乳油穩定性測定

2.5.1 標準穩定性測定 在實驗室用恒溫水浴鍋在30 ℃下在硬水（CaCl、MgCl）中對所選理想乳油進行1 h的標準穩定性測定，觀察結果為無浮油、浮膏和沉淀，乳油合格。說明CaCl與MgCl在水中的各種離子鍵（Ca2+、Mg2+、Cl-1）對乳化的各種分子鍵沒有破壞作用。

2.5.2 低溫穩定性測定 在實驗室0 ℃下對所選理想乳油進行低溫穩定性測定，結果觀察沒有任何析出物或沉淀，沒有顏色和狀態的變化，低溫穩定性較好。本來各種單一乳化劑和有機溶劑以及細辛精油在低溫為合適的儲存方式，所以乳油在0 ℃低溫下，穩定性也會比較好。

2.5.3 高溫穩定性測定 在實驗室用恒溫箱54 ℃進行14 d的高溫穩定性測定，熱貯前含量為6.336 1 g，熱貯后含量為6.024 8 g，熱貯分解率為4.913 1%，但能觀察到少許黑色沉淀物，說明經過高溫穩定性測定，乳油發生變化，但質量變化不大，熱貯分解率≤5%，即高溫穩定性較好。

2.5.4 穩定性測定后的抑制作用 在實驗室內，采用生長速率法測定穩定性處理后乳油對黃瓜灰霉病菌的抑制作用，結果見表5。0 ℃貯藏后，EC50為298.89 mg/L，是處理前乳油EC50為238.82 mg/L的1.25倍，即低溫貯藏后，細辛精油乳油的藥效略有下降;54 ℃貯藏，EC50僅為4.58 mg/L，約為處理前的1/50，表明所配制的乳油高溫貯藏后藥效提高。

2.6 藥效對比試驗

在實驗室采用生長速率法比較篩選出的理想細辛精油乳油與較廣泛使用的殺菌劑（苦參堿、蠟質芽孢桿菌、霜霉立克和福美雙）對黃瓜灰霉病菌的抑制作用，結果見表6。4種已經推廣使用殺菌劑的EC50均低于220 mg/L，即對黃瓜灰霉病菌的抑制效果都比較理想。所配制的細辛精油乳油的EC50為238.82 mg/L與福美雙EC50為219.72 mg/L的抑制效果相當，說明細辛精油乳油可以推廣應用于農業生產。

3 結論與討論

植物源農藥來源于自然，殺菌譜廣，毒性小，不易產生藥害，對人畜健康危害小，并且有助于提高農產品質量。細辛精油抑菌譜較廣，具有開發成植物源農藥的價值。本研究以細辛精油為原料，通過溶解度、分散性、配比和穩定性試驗等優化了其乳油配方：N-甲基吡咯烷酮、植物油乳化劑為最佳的有機溶劑和乳化劑，二者的最佳混合比為9 ∶ 1;最佳的細辛精油乳油配方為細辛精油 ∶ 有機溶劑 ∶ 乳化劑=10（25.0%） ∶ 27（67.5%） ∶ 3（7.5%）。所配細辛精油乳油的穩定性較好，其對黃瓜灰霉病菌的抑制作用與50%的福美雙WP的抑制效果相當。其制備方法特征是，先將植物油乳化劑與N-甲基吡咯烷酮按比例混合均勻，再加入細辛精油。該乳油的研制成功，填補了國內尚無植物精油乳油制劑的空白，將滿足人們對綠色蔬菜和有機蔬菜的需求，推廣使用必將帶來巨大的生態、經濟和社會效益。

乳油是農藥傳統的、常見的基本劑型之一，相較其他農藥劑型而言，乳油具有諸多優勢，工藝簡單，藥效高，施用方便，性質較穩定，便于長期儲存，防治效果較為理想。因而使農藥乳油制劑產品在農作物的防蟲和除草方面發揮出了良好的應用價值，至今仍舊是我國及大多數發展中國家所使用的主要農藥劑型之一，占制劑產量的50%[14]。

乳油由原藥、有機溶劑、乳化劑和其他成分組成，使用時直接加水稀釋。溶劑對原藥起溶解和稀釋作用，要求對原藥溶解度大，與原藥相容性好等。國際上有在農藥制劑中禁用甲苯、二甲苯等有機溶劑的規定;我國臺灣地區農業委員會對二甲苯、苯胺、苯、四氯化碳、三氯乙烯等農藥產品中使用的38種有機溶劑進行了限量管理;2006年以來，工業和信息化部、國家發展改革委員會等陸續出臺政策，在適當的時候除一些只適合制備乳油的農藥產品外，停止以苯、甲苯、二甲苯等芳烴類為溶劑的乳油產品生產。本研究選用非限制性的N-甲基吡咯烷酮為配制細辛精油乳油的較理想有機溶劑，該溶劑沸點高、極性強、黏度低、溶解能力強、無腐蝕、毒性小、生物降解能力強、揮發度低、化學穩定性優良、熱穩定性優良，廣泛應用于石油化工、藥品、農藥等許多方面[15]。乳化劑是乳油配方篩選的關鍵，使得原本互不相容的油水充分混合乳化并長期穩定存在，乳化后的乳液具有極高的穩定性[14]。乳油制劑的禁限還與其中必不可少的乳化劑有一定的關系。烷基酚聚氧乙烯醚類乳化劑由于其生物降解性差，并隨著降解過程，毒性增大，對魚類、無脊椎動物、海藻和微生物具有很高毒性[16]。本研究中作為最佳乳化劑（植物油乳化劑）和有機溶劑（N-甲基吡咯烷酮）避免了這些問題，研制的理想乳油也克服了傳統乳油存在的問題。

我國是一個農業大國，農藥在農業生產中發揮著十分重要的作用。為了降低農藥殘留量，努力開發新型農藥已經成為當務之急。生物農藥又稱天然農藥，在有機農業使用的整合害蟲管理系統（IPM）中扮演重要的角色。植物源農藥作為綠色農藥之一，在未來的植物保護中肩負著巨大的歷史使命[17-18]。湖北省農業科學院喻大昭研究員團隊從植物代謝產物中發現和創制了用于防治植物病害的天然蒽醌類農用系列殺菌劑，榮獲第十七屆中國專利獎金獎[19]，自2006年獲得發明專利授權后，產品累計應用面積達141.07萬hm2，創造經濟效益43億元。0.5%丁子香酚可溶液劑250倍液+1.3%苦參堿水劑500倍液果穗套袋前混用浸果對葡萄灰霉病防效達85%以上[20];LS-1是東北農業大學植物保護系研制的植物源殺菌劑，對番茄葉霉病、番茄早疫病和黃瓜霜霉病均有良好的防治效果，與甲基托布津和諾毒霉等防效相當[21];20%銀泰EC在0～200 μg/mL濃度范圍內，對早疫病菌的抑菌活性和對照藥劑撲海因基本相當，對灰霉病菌的抑菌活性強于撲海因[22]。本研究表明，25.0%的細辛精油乳油對黃瓜灰霉病菌的EC50為238.82 mg/L與福美雙EC50為219.72 mg/L的抑制效果相當，說明細辛精油乳油可以推廣應用于農業生產。

近年來，隨著國內農資市場向外開放，一些歐美企業將新型的植物源農藥帶進我國市場，體現了強大的生命力。Michael等以殼聚糖和植物農藥為原料，研制了殼聚糖納米農藥制劑CSNS-TPP-PONNEM，該制劑對棉鈴蟲的拒食活性為88.5%，殺蟲活性為90.2%[23]。今后需進一步加大細辛提取物及其他植物源農藥新劑型的研究。

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