小于胎齡兒母嬰血漿中甜菜堿的水平及其與孕婦糖代謝的關系

翟 笑 劉潔穎 李融融 劉俊濤 宋英娜 馬良坤 喬宗旭 趙貴芬 王瑞平 張 茜 鄧明群 付俊玲 周麗媛 趙 楠 宋 瑋 肖新華

孕期營養對子代的健康起著非常重要的作用，懷孕期間孕婦營養狀態異常，可能會導致兒童期及成年早期肥胖及代謝性疾病發生風險增加，目前最新的證據發現，微量營養素也在其中發揮著重要的作用[1～3]。甜菜堿是同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉化的重要甲基供體，可滿足快速分裂細胞中甲基的增加需求。因此，適量的甜菜堿供應將為表觀基因組編程提供有利環境。甜菜堿包含在富含小麥的食品中，可以通過氧化必需的營養膽堿來合成[4～6]。現有的研究已發現，孕婦體內甜菜堿的狀態與臍帶血中甜菜堿濃度密切相關[7]。

小于胎齡兒(small for gestational age, SGA)是指出生體重低于同胎齡兒平均值第10百分位數的一組新生兒[8]。相比于宮內生長正常的嬰兒，因遺傳或環境因素導致胎兒未達完全宮內生長潛能，其成年期慢性病風險增加，例如肥胖、2型糖尿病、心腦血管疾病等[9,10]。而在針對動物及人的研究中均發現，補充甜菜堿可以引起體重及脂肪組織減少，凈體重(lean body mass, LBM)增加，然而孕婦及新生兒體內的甜菜堿水平與新生兒出生體重間的關系尚不明確[11,12]。本研究通過液相質譜的方法，比較分析SGA組與適于胎齡兒組(appropriate for gestational age, AGA)兩組孕晚期產婦外周血血漿及新生兒臍血血漿的代謝物差異，發現兩組的甜菜堿水平存在明顯差異，并進一步分析甜菜堿與新生兒體重間的相關性，試圖尋找SGA胎兒宮內發育異常的可能機制。

對象與方法

1.研究對象:2017年11月～2018年5月于北京協和醫院和邢臺市人民醫院招募128對足月孕婦及其新生兒(孕周≥37周)，根據新生兒出生體重，選取其中15例SGA及24例適于胎齡兒(appropriate for gestational age, AGA)的孕婦及新生兒為研究對象[13]。排除標準：孕婦方面包括合并高血壓、子癇前期，雙胎或多胎妊娠，合并其他可能會對代謝有影響的疾病(包括甲狀腺功能亢進、肝功能不全、慢性腎炎等)，孕期服用阿司匹林、二甲雙胍、糖皮質激素等，孕期有吸煙、酗酒、麻毒藥品使用史等；新生兒方面除外嚴重畸形、染色體異常或嚴重遺傳病、青紫型先天性心臟病或有血流動力學改變的非青紫型先天性心臟病。全部患者均簽署知情同意書，本研究通過北京協和醫院醫學倫理學委員會許可。

2.研究方法:采集足月孕婦分娩前空腹全血2ml，待胎兒分娩后，新生兒臍帶結扎后，用注射器抽取臍血2ml。采集血樣裝入含有EDTA作為抗凝劑的采血管中，緩慢上下混勻血液和管壁上的抗凝劑后，在4℃，1000×g(3000r/min)離心力的作用下低溫離心10～15min；吸取上清至干凈的EP管中，保存在-80℃冰箱中。

研究采用超高液相色譜質譜法的方法(ultra highperformance liquid chromatography-tandem mass spectroscopy, UPLS-MS)檢測。首先將待測血漿于常溫下解凍，取100μl樣本，加入300μl乙腈，于-20℃預冷，渦旋振蕩1min后于-20℃靜置過夜。于4℃、12000r/min,離心20min，取上清，1×水稀釋，取其中100μl到進樣瓶。

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class儀器進行色譜分離，色譜條件：HSS-C18色譜柱(100.0mm×2.0mm, 1.7μm)；流動相A相為0.1%(體積分數)甲酸水溶液，B 相為0.1%(體積分數)甲酸-乙腈溶液；流速0.3ml/min；柱溫40℃；流動相梯度洗脫條件：0～0.5min, 99%A；0.5～2.0min，99%到50%A；2～9min，50%到1%A；9～10min,1%A；10.0～10.5min, 1%～99%A；10.5～12.0min, 99%A。

質譜檢測采用Waters公司的XevoG2-XS Qtof系統。Masslynx軟件基于MSE(全信息串聯質譜)模式對樣品進行數據采集。質譜條件：在正離子采集模式下，毛細管電壓：2.5kV，錐孔電壓24V，離子源溫度100℃，去溶劑氣流速800L/h，錐孔氣流速50L/h，14min內對m/z為50～1500Da的離子進行掃描，0.2秒/循環。在負離子采集模式下，毛細管電壓：2.5kV，錐孔電壓25V，離子源溫度100℃，去溶劑氣流速600L/h，錐孔氣流速10L/h，14min內對m/z為50～1500Da的離子進行掃描，0.2秒/循環。

檢測孕婦血漿中血糖、胰島素水平，胰島素測定使用Siemens Centaur XP 全自動化學發光免疫分析儀進行測定，使用Siemens試劑盒，采用直接化學發光法，雙抗夾心免疫測定方法進行檢測。糖化血紅蛋白測定采用離子交換高效液相色譜法(試劑盒Bio-Rad Variant Ⅱ Turbo)。

3.統計學方法：樣品檢測后，經Markerlynx軟件(Version 4.1 Waters)數據處理系統對采集的譜圖進行峰識別、峰對齊等操作，得到數據矩陣。再經EZinfo軟件(Version 3.0 Waters)進行多元統計分析，以篩選和分組相關的差異代謝物。建立OPLS-DA(正交偏最小二乘法-判別分析)散點得分圖。通過HMDB(www.hmdb.ca)精確質量數據庫，結合二級質譜圖和標準品對照，發現孕婦及臍血甜菜堿水平在兩組間比較差異有統計學意義。將檢測到的孕婦外周血血漿及臍血血漿中的甜菜堿濃度通過EXCEL進行數據標準化處理，用協方差分析，對孕婦年齡、孕晚期BMI、胎齡3個的混雜因素進行校正，比較兩組間差異。

結 果

1.人口學特征比較:孕婦年齡、分娩時BMI、收縮壓、舒張壓、分娩方式、胎齡、新生兒性別等，在兩組間比較差異無統計學意義。其中，兩組中新生兒性別，男性均多于女性，在SGA組更突出，但兩組間差異無統計學意義(P>0.05),詳見表1。

2.兩組孕婦及新生兒臍血代謝組學聚類分析(OPLS-DA得分散點圖):兩組樣本母嬰血漿代謝物坐標點的空間分布差異較大，說明兩組孕婦及新生兒臍血血漿的代謝物分布存在差異(圖1、圖2)。

表1 人口學特征

圖1 SGA組和AGA組孕婦血OPLS-DA散點得分圖SGA-M.SGA組孕婦；AGA-M.AGA組孕婦

圖2 SGA組和AGA組新生兒臍血OPLS-DA散點得分圖SGA.SGA組新生兒;AGA.AGA組新生兒

3.兩組孕婦及新生兒臍血甜菜堿水平比較及母嬰關聯分析:表2及圖3顯示，在校正了孕婦年齡、分娩時BMI、胎齡、新生兒性別后，SGA新生兒血甜菜堿水平顯著低于AGA組，差異有統計學意義(P=0.021)。SGA組孕婦的血甜菜堿水平低于AGA組，趨勢明顯，但差異無統計學意義(P=0.09)。兩組中臍血血漿中甜菜堿水平均明顯高于孕婦外周血血漿中甜菜堿水平。孕婦外周血甜菜堿水平與新生兒臍血甜菜堿水平存在明顯相關趨勢(校正孕婦孕晚期體重、糖化血紅蛋白、新生兒出生體重、新生兒性別)，但差異無統計學意義(r=0.394，P=0.069)。

表2 兩組母嬰血漿甜菜堿水平比較

圖3 兩組母嬰甜菜堿水平比較甜菜堿數值為標準化后結果；SGA、AGA代表兩組孕婦血漿中甜菜堿水平，SGA-F、AGA-F代表兩組新生兒臍血中甜菜堿水平

4.兩組孕婦孕晚期糖代謝水平比較及與甜菜堿相關性分析：比較兩組孕婦空腹血糖、糖化血紅蛋白、胰島素及HOMA-IR指數水平，差異均無統計學意義(表3)。孕婦孕晚期甜菜堿水平與空腹胰島素水平、HOMA-IR指數進行相關分析，均呈明顯負相關(r=-0.465,P=0.004；r=-0.548,P=0.000，圖4、圖5)。

表3 兩組孕婦血糖、胰島素水平比較

圖4 孕婦甜菜堿水平與空腹胰島素相關性曲線甜菜堿為標準化后結果

圖5 孕婦甜菜堿與HOMA-IR指數的相關性曲線甜菜堿為標準化后結果

5.新生兒臍血甜菜堿水平與新生兒出生體重、臍血胰島素水平相關性：如圖6所示，新生兒臍血甜菜堿水平與出生體重呈負相關(r=-0.410，P=0.018)。臍血甜菜堿水平與臍血胰島素水平呈明顯負相關(r=-0.469，P=0.010)。

圖6 新生兒出生體重與臍血甜菜堿水平的相關性曲線 胎甜菜堿是指臍血血漿甜菜堿水平，為標準化后結果

討 論

本研究發現，SGA組臍血甜菜堿水平明顯高于AGA組，SGA組孕婦血漿甜菜堿水平與AGA組比較，也存在升高趨勢。同時，臍血甜菜堿水平與新生兒出生體重呈明顯負相關。此前，國外已有2項研究分別報道了孕婦孕期的甜菜堿水平以及臍血的甜菜堿水平與新生兒出生體重呈負相關，與本研究結果一致[14,15]。但本研究前瞻性地納入SGA組及AGA組孕婦，孕婦樣本均在孕37周后留取，并進行母嬰配對分析，創新性強，結果更加可靠。

關于甜菜堿可影響新生兒出生體重的生物學機制，目前尚不明確。低出生體重/宮內發育遲緩與成年期肥胖、2型糖尿病、代謝綜合征等疾病密切相關，目前來自于動物和人體的研究認為，其中主要的發病機制，可能與胎兒脂肪發育不良以及表觀遺傳學的改變有關[9,10]。脂肪組織為新生兒體重的重要組成部分，有研究發現，臍血甜菜堿濃度與新生兒腹部皮下脂肪的減少相關，因此推測，胎兒的高甜菜堿環境會改變胎兒期皮下脂肪組織的代謝和形態[15]。胎兒期脂肪組織的代謝和形態改變，以及后期出現的嬰兒期的追趕生長，為低出生體重兒成年期發生肥胖、代謝綜合征的重要原因[16]。綜上所述，胎兒期的高甜菜堿環境可能會通過影響胎兒的脂肪發育，而導致成年期代謝綜合征的發生風險增加。

另一機制可能為表觀遺傳學的改變。甜菜堿為同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉化的重要甲基供體，高甜菜堿濃度可引起同型半胱氨酸向甲硫氨酸轉化增加。動物研究發現，給3月齡母鼠補充甜菜堿可引起子代出生體重下降；伴隨子代IGF-1基因高度甲基化和肝臟IGF-1 mRNA表達的下降[17]。另有研究發現，母豬妊娠期增加甜菜堿攝入可以通過表觀遺傳和糖皮質激素受體(GR)介導，減少子代的肝臟脂肪生成[18]。目前暫無人類妊娠期甜菜堿補充與表觀遺傳方面的研究報道，甜菜堿在妊娠期如何通過影響表觀遺傳學，影響新生兒出生體重，還有待于進一步驗證。

在非妊娠人群和動物的研究中已發現，補充甜菜堿可以引起體重及脂肪組織減少，凈體重增加；糖尿病預防計劃(DPP)發現，甜菜堿水平與2型糖尿病的發生呈負相關，且糖尿病高危人群經生活方式干預或二甲雙胍治療，血甜菜堿水平增加[11,12,19]。另有研究發現，胰島素抵抗人群中甜菜堿水平明顯減低，甜菜堿水平與胰島素敏感度明顯相關；后續的動物研究發現，甜菜堿補充劑通過增加成纖維細胞生長因子21(FGF21)的表達來改善大鼠葡萄糖穩態。最新的動物研究發現，母代補充甜菜堿的子代大鼠的肝臟IGF-2 mRNA和蛋白表達上調，血IGF-2水平升高；同時，甜菜堿-同型半胱氨酸甲基轉移酶及DNA甲基轉移酶1的表達增加，IGF-2/H19區域的甲基化水平上調「20」。

甜菜堿在非妊娠人群存在代謝保護作用，且與胰島素敏感度密切相關。本研究發現，妊娠人群的血甜菜堿水平與空腹胰島素水平、HOMA-IR指數呈負相關，這與在非妊娠人群中的報道一致。妊娠人群在產后的胰島素敏感度是否可持續尚不清楚。

綜上所述，妊娠人群的高甜菜堿血癥與胰島素敏感度增加有關，但其高甜菜堿狀態可通過影響臍血甜菜堿水平，引起子代出生體重減少，導致SGA的風險增加，是新生兒未來糖脂代謝健康的不利因素。因此，探究妊娠期最優的甜菜堿環境，明確其中潛在的病理生理機制，進而通過對其調控以減少孕婦及子代未來肥胖、2型糖尿病等疾病的患病風險，是今后亟待探求的科學問題。