rhEPO減輕糖尿病大鼠尿蛋白排泄機制的實驗研究

劉慧娟 黃 雯 張 梅 陳 燊

糖尿病腎病是主要的糖尿病微血管并發癥之一，腎小球內皮細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，直接受到血液中高濃度血糖、糖基化蛋白終末產物和氧化應激反應的影響。腎小球內皮細胞的損傷產生細胞因子和血管活性物質還影響腎小球足細胞的生物學行為，從而影響腎小球濾過屏障的功能。

內皮祖細胞(EPCs)是存在于循環血液中的骨髓來源的細胞，同時具有干細胞和內皮細胞的生物學標志。EPCs的數量和功能的變化能直接反映內皮細胞功能損傷。有關內皮祖細胞的研究顯示，1型和2型糖尿病患者循環內皮祖細胞的數量和功能都較正常人有所下降，其數目和功能的下降與血管內皮功能失調及血管修復能力下降密切相關[1]。目前EPCs修復內皮細胞損傷的研究多以體外培養擴增，體內移植為基礎，能否通過藥物治療來改善EPC的數量和功能，成為國內外新的研究方向。重組人促紅細胞生成素(rhEPO)是一種調節紅細胞生成的糖蛋白類激素，主要作用為誘導骨髓原始紅細胞分化，促進外周血紅細胞生成。近年來，研究發現促紅細胞生成素除了治療貧血外，還可以動員骨髓EPCs到外周血中，在血管新生中發揮重要作用[2～5]。實驗也證實了rhEPO在體外可以增強EPCs的活性，其增殖、黏附和遷移功能是與其參與血管新生直接相關的[6]。

材料與方法

1.實驗動物:SD大鼠，雄性，鼠齡6～8周，體質量170～190g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司(實驗動物許可證號為SKXK京2012-0001)，適應性喂養5天后進行實驗。試驗組(28只)：按60mg/kg一次性腹腔快速注射2%的STZ液。對照組(NC組)7只：按60mg/kg一次性腹腔注射檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。在注射STZ后72h采集兩組動物的尾靜脈血，用快速血糖測定儀測定血糖，血糖濃度>16.7mmol/L判定為1型糖尿病動物模型。模型不達標者，3天后以40mg/kg再次腹腔注射2%的STZ液。隨機將實驗組大鼠分為3組：①糖尿病組(DM組)9只；②應用25U/kg的rhEPO治療組(DMTA組)9只；③應用50U/kg的rhEPO治療組(DMTB組)10只。每周3次，連用8周。EPO注射8周后處死所有大鼠。

2.實驗儀器:XN-1000全自動血液分析儀 (日本Sysmex公司)；UniCel Dxi 800全自動化學發光免疫分析儀(德國Becman Counter公司)；NovoCyte D206OR 流式細胞儀(艾森生物杭州有限公司)。

3.實驗試劑：重組人促紅細胞生成素(rhEPO)(益比奧，沈陽三生制藥公司)；兔抗大鼠VEGFR-2多克隆抗體、小鼠抗大鼠JG12單克隆抗體、PE標記的小鼠抗大鼠CD34多克隆抗體[艾博抗(上海)貿易有限公司]；鏈脲佐菌素(STZ)(北京博愛港經貿中心)。

4.大鼠血壓測量：37℃條件下預加溫5min后固定尾動脈，使用大鼠智能無創血壓測定系統測定大鼠血壓。每只大鼠重復測量3次，取平均值。

5.標本留取檢測血、尿相關指標：處死前24h將所有大鼠單個置于代謝籠中。(1)尿液：收集24h尿標本，離心后取上清測尿微量白蛋白含量。(2)血液：2%戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔給藥，麻醉后，從腹主動脈取血5ml，其中3ml用來檢測血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)，另2ml用2%EDTA抗凝，行血常規及裂解紅細胞后流式細胞儀檢測。ELASA法測定尿微量白蛋白(按照說明書操作)。

6.大鼠外周血EPCs的分離、鑒定:(1)CD34/VEGFR-2雙陽性細胞的標記方法(VEGFR-2為間接標記):①取100μl血樣至ISO和Test管，加紅細胞裂解液1ml，震蕩儀震蕩，反應8min后離心，棄去上清液。1%BSA-PBS緩沖液洗滌；②加入VEGFR-2抗體(間接標記一抗)1μl，混勻，4℃孵化1h。1%BSA-PBS緩沖液洗滌；③加APC標記的羊抗兔二抗1μl(10μl二抗+90μl PBS稀釋濃度為0.2μg/μl)，再加PE標記的CD34抗體5μl，混勻，4℃避光孵化1h。1%BSA-PBS緩沖液洗滌；④加入1%BSA-PBS緩沖液0.5ml重懸細胞，流式細胞儀檢測熒光值，每管計數50000個細胞。(2)流式細胞術檢測:經流式細胞儀計數時，首先根據FSC/SSC設門，在散點圖中圈選單個核細胞區域，排除雙聯體細胞、血小板、細胞碎片、微顆粒等雜質，依據CD34SSC設第2個門，圈定PE-CD34陽性的細胞群區域，第3個門用來選取CD34和VEGFR-2雙陽性細胞，并在收集50000個細胞后停止檢測，計數CD34和VEGFR-2雙陽性細胞。

7.免疫組織化學:①脫蠟、水化組織切片，進行抗原熱修復；②3%H2O2去離子水孵育5～10min，阻斷內源性過氧化物酶；③滴加JG-12一抗(1∶100)，4℃冰箱過夜；④滴加二抗，室溫孵育40min；⑤0.05% DAB顯色，鏡下控制染色結果；⑥蒸餾水充分沖洗，蘇木精復染,梯度乙醇脫水,二甲苯誘明,中性樹膠封片。JG12免疫組化分析：根據腎小球染色結果，每張切片隨機選取10個腎小球，經QUIN軟件劃出腎小球的范圍，顯示腎小球面積，選中腎小球中染色陽性的區域，顯示染色陽性面積，計算JG12與腎小球總面積的比值，然后取平均值。

結 果

1.rhEPO對糖尿病大鼠血Scr、血BUN、血ALB、血紅蛋白、血壓、血糖和腎重量/體質量的影響:于皮下注射EPO 8周后，發現糖尿病組血BUN較對照組明顯升高(P<0.05)，血ALB較對照組明顯降低，應用rhEPO治療后血Scr、血ALB水平與糖尿病組比較，差異無統計學意義(表1)。各組大鼠血壓無變化，糖尿病組血糖和腎重量/體質量較對照組明顯升高，應用rhEPO后無變化(表2)。

表1 各組大鼠8周血Hb、HCT、BUN、Scr、ALB的變化

表2 各組大鼠8周血糖、腎重量/體質量比、血壓的變化

2.rhEPO對糖尿病大鼠24h尿微量白蛋白的影響:rhEPO皮下注射8周后，檢測各組大鼠24h尿微量白蛋白，發現糖尿病組24h尿微量白蛋白較對照組顯著增高，DMTB組24h尿微量白蛋白較糖尿病組顯著降低，而DMTA組尿微量白蛋白有降低趨勢，差異無統計學意義(表3)。

表3 各組大鼠8周24hUAlb的變化

3．rhEPO對糖尿病大鼠腎臟Aminopeptidase P(JG-12)表達的影響:DM組腎小球JG12表達均較對照組顯著減少(P<0.05)，應用rhEPO治療后，JG-12表達增加，大劑量組增加更為明顯(P<0.05,圖1、圖2)。

圖1 JG12免疫組化染色(×400)A.NC組；B.DM組；C.DMTA組；D.DMTB組

圖2 腎小球毛細血管JG-12的表達與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

4.rhEPO對糖尿病大鼠外周血EPCs的影響:應用rhEPO治療糖尿病大鼠后，其外周血中EPCs的數量有增加趨勢，呈劑量依賴性，DMTB組EPCs數量增加更為明顯，但差異無統計學意義(圖3、圖4)。

圖4 外周血EPCs的數目

討 論

糖尿病腎病(DN)臨床表現為蛋白尿、漸進性腎功能損害或晚期出現嚴重腎衰竭，是患者的主要死亡原因之一。本實驗結果顯示，糖尿病大鼠24h尿微量白蛋白排泄明顯升高，較高劑量rhEPO治療組與糖尿病組比較，尿微量白蛋白顯著下降。較低劑量的rhEPO治療組尿微量白蛋白排泄亦有下降趨勢。

在糖尿病腎病進展的患者中，腎小球毛細血管的減少是腎小球濾過率下降的關鍵事件，伴隨著微血管的塌陷，缺氧的環境提供了纖維化的潛在刺激，導致以腎小球硬化和腎間質纖維化為特點的晚期糖尿病腎病[7]。JG-12是毛細血管的特異性標志物。在本研究中，選取JG-12作為腎小球內皮細胞的標志物檢測各組大鼠微血管內皮的損傷和修復。實驗結果顯示，糖尿病大鼠腎小球JG-12表達明顯減少，說明在STZ糖尿病大鼠出現的腎臟微血管病變以腎小球微血管內皮損傷和毛細血管的萎縮、減少為特征性表現，與以往的研究結果一致[8]。內皮細胞數量減少、功能受損、毛細血管萎縮、丟失等微血管病變導致腎組織慢性缺血、缺氧和營養供應缺乏。內皮是接觸血液的首個屏障，血管內皮細胞一旦出現損傷，其合成和釋放多種血管活性物質(如NO)和細胞因子(如血管內皮生長因子VEGF)之間的平衡被打亂，引起功能障礙，可累及人體多個臟器。

結合前期的研究，筆者認為內皮細胞的損傷直接影響其旁分泌細胞因子和血管活性物質，以及與腎小球系膜細胞、足細胞和腎小管上皮細胞、腎間質成纖維細胞的信號交流，內皮細胞本身的表型亦發生改變，致使組織損傷和保護因素之間的平衡被打破，是腎臟進一步損傷的基礎[9～11]。STZ大鼠的微量白蛋白尿排泄增加和內生肌酐清除率的上升與此有關。此時，內皮損傷若不及時修復將會導致病變加重直至腎小球硬化和腎間質纖維化。

在內皮損傷的修復方面，多項研究認為，骨髓來源的、存在于循環中的具有血管生成潛能的細胞對內皮細胞的修復是主要的修復方式[12，13]。內皮祖細胞即是具備內皮生成潛質的細胞，它可以增殖、分化并移行至損傷部位成為內皮細胞，執行其功能[14～16]。目前，相關的實驗研究主要是將骨髓或外周血中的內皮祖細胞收集，體外培養，增殖至一定的數量回輸[17，18]。實驗在體外進行，耗時長，治療間斷進行，回輸的細胞在體外培養有表型轉變的風險。因此，本研究嘗試尋找促使體內內皮祖細胞補充的方法。

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是最早發現并應用于臨床的造血因子之一，除了具有治療貧血、抗炎、抗氧化應激等作用外，還可以刺激內皮祖細胞介導的內皮恢復，在組織局部缺血部位參與新生血管的形成。本研究中，應用EPO治療的大鼠，尿微量白蛋白明顯下降，腎小球JG-12表達明顯增加，提示腎小球微血管內皮損傷得到了一定程度的修復。同時，rhEPO治療的糖尿病大鼠，尿微量白蛋白排泄較糖尿病組大鼠減少，并呈劑量依賴，提示腎臟結構及功能得到改善，與微血管內皮損傷的修復有關。大鼠應用EPO皮下注射8周后，發現外周血內皮祖細胞數量有升高趨勢，且與劑量呈正相關，這與報道相一致[8]。在本研究中，糖尿病大鼠經rhEPO干預后，毛細血管的標志JG-12的變化與循環內皮祖細胞的變化趨勢一致，筆者推測內皮祖細胞可能直接參與了內皮損傷的修復。但外周血內皮祖細胞只有升高趨勢，差異無統計學意義。其可能的原因為EPO促進EPCs增加，這與高血糖所致的EPCs減少尚未達到一定的平衡有關，模型時間只有8周，或還不足以引起外周血中EPCs的明顯差異，可能通過延長實驗時間或調整劑量明確EPCs的變化，這有待于進一步研究。

近年來研究發現刺激EPCs的骨髓動員，可使其遷移到損傷組織，分化成內皮細胞并形成新生的血管，EPCs不僅參與胚胎血管生成，也參與出生后的血管新生過程。新生血管中25%的內皮細胞是由EPC分化而來的[19，20]。EPC通過自身的分化、增殖而形成的新生血管不受原有血管內皮細胞功能的影響，且受損的內皮層可由循環EPC重生，EPC可促進重新內皮化。有研究表明，糖尿病患者的內皮祖細胞除了數量下降，其遷移和歸巢功能也有一定程度的減弱[18]。本研究僅就EPO對糖尿病大鼠循環內皮祖細胞數量的變化與腎臟結構功能的變化的關系進行了探討，但EPO可能對內皮祖細胞的內皮修復作用在遷移、歸巢、分化等不同的環節有更多的作用，需要實驗進一步研究。