鹽酸小檗堿聯合甘草酸二銨對非酒精性脂肪性肝病患者Th17/Treg細胞失衡及腸道菌群的影響

黃佩佩 胡云明 吳建勝

非酒精性脂肪性肝病以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變為主要病理特征，包括從單純肝脂肪變性到非酒精性脂肪性肝炎，一些患者最終可演變為肝硬化甚至肝細胞癌[1]。據報道一般人群的非酒精性脂肪性肝病發生率為10%～16%，而在肥胖患者中發生率高達38%，近年來隨著人們工作壓力的增加，飲食、生活習慣不規律，非酒精性脂肪性肝病的發生率呈逐年上升趨勢[2]。目前臨床對非酒精性脂肪性肝病尚缺乏特效治療藥物，治療方法主要是改變患者的生活方式、減輕體質量等[3]。鹽酸小檗堿片是從中藥黃連根莖中提取的主要生物堿，對糖尿病、高脂血癥、肥胖癥等代謝綜合征起到了防治療效，也是一種治療非酒精性脂肪性肝病的藥物。甘草酸二銨腸溶膠囊能夠促進非酒精性脂肪性肝病患者的糖脂代謝好轉，有抗炎、改善胰島素抵抗以及保護肝細胞等作用[5]。然而目前采取水飛薊賓膠囊聯合鹽酸小檗堿片治療非酒精性脂肪性肝病的研究鮮見報道。非酒精性脂肪性肝病是一種多因素作用所導致的臨床病理綜合征，免疫功能失衡和腸道菌群紊亂在該病的發生、發展過程中發揮了重要作用[6,7]。基于此，本研究選取溫州醫科大學附屬樂清醫院2017年2月～2018年8月收治的104例病例作為研究對象，觀察鹽酸小檗堿片聯合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的治療效果，并探討其對調節性T 細胞(Treg)/輔助性T細胞17(Th17)平衡以及腸道菌群的影響。

對象與方法

1.研究對象: 104例非酒精性脂肪性肝病患者來源于溫州醫科大學附屬樂清醫院2017年2月～2018年8月收治病例，非酒精性脂肪性肝病診斷參照《中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010 年修訂版)》擬定[8]。納入標準：①符合非酒精性脂肪性肝病診斷標準者；②患者年齡20～65歲；③丙氨酸氨基轉移酶(ALT)異常升高≥4周；④近1個月內未給予相關藥物治療；⑤患者自愿參加，且簽署知情協議。排除標準：①飲酒史或乙醇量女性每周>70克/周，男性>140克/周；②伴病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病、肝豆狀核變性病等其他肝病;③對本研究藥物過敏者；④合并心腦血管、腎臟、造血系統等嚴重疾病；⑤患精神疾病者。兩組治療過程中均未出現脫落病例，將104例患者按數字表法隨機分為對照組和觀察組，每組各52例。對照組男性31例，女性21例，年齡44～62歲，平均年齡55.17±7.12歲，病程3～7年，平均病程5.11±0.71年，體重指數25.15±3.04kg/m2；并發癥：2型糖尿病8例，高血壓15例，高脂血癥19例。觀察組男性33例，女性19例，患者年齡46～61歲，平均年齡55.39±7.04歲，病程2.5～7.0年，平均病程5.01±0.67年，體重指數25.09±3.04kg/m2；并發癥：2型糖尿病7例，高血壓13例，高脂血癥18例。上述基本臨床資料兩組患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

2.方法：(1)基礎治療：依據指南[8]給予非藥物干預措施。包括對患者進行健康教育；平衡膳食，控制體重；注意休息，適當有氧運動(每周>4次，每次>30min)。對照組：采取甘草酸二銨腸溶膠囊(正大天晴藥業集團股份有限公司，批準文號H20040628)，口服，3粒/次，3次/天。觀察組：在對照組治療基礎上給予鹽酸小檗堿片(南京白敬宇制藥有限責任公司，批準文號H32023081)，口服1～3片/次，3次/天。兩組療程均為12周。

3.觀察指標：(1)肝功能：采取全自動生化分析儀(AU5800，美國Beckman Coulter公司)測定患者的谷草轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)以及谷氨酰轉肽酶(GGT)，在治療前及治療12周后各測1次。(2)血脂:采取全自動生化分析儀(AU5800，美國Beckman Coulter公司)檢測患者的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，在治療前及治療12周后各測1次。(3)兩組外周血輔助性T細胞17(Th17)和調節性T細胞(Treg)水平:清晨空腹下抽取患者的外周血3ml左右，常規離心后將其加入磷酸鹽緩沖液洗滌，制備細胞懸液；采取流式細胞儀(FC-500型，美國Beckman Coulter公司)在治療前及治療12周后測定，其中Th17細胞為CD4+白細胞介素(IL)-17+，Treg細胞為CD 4+CD25+CD127lowTreg。(4)兩組腸道菌群測定:標本取樣：在治療前及治療結束后留取患者的自然排便新鮮糞便中段0.5g，置于樣本袋存于-4℃冰箱。標準菌株DNA提取：取雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、腸球菌凍干粉各0.2g，溶解于磷酸緩沖液溶液中，采用細菌DNA提取試劑盒提取標準菌株DNA，采用紫外分光光度計定量，進行10倍稀釋，采用系統軟件分析循環閾值(Ct)，生成標準曲線，計算標準品PCR片段拷貝數。樣本細菌DNA提取、16SrDNA定量PCR：糞便樣本融凍，取0.2g以磷酸鹽緩沖液處理，1000r/min離心10min，取上清200μl，同標準菌株DNA提取法提取樣本細菌DNA，以標準菌株16SrDNA V3區為PCR靶基因，采用Primer Premier 6.0引物設計軟件設計PCR引物，對樣本細菌DNA提取液施行PCR反應，生成樣本細菌Ct值，計算樣本拷貝數。(5)療效評定標準[9]:根據患者的肝臟酶學改變制定。臨床控制：肝臟酶學恢復正常；顯效：肝臟酶學指標降低≥50%；有效：肝臟酶學指標降低<50%但≥30%；無效：肝臟酶學指標降低<30%。總有效率(%)=(臨床控制+顯效+有效)人數/各組人數。

結 果

1.兩組肝功能比較：治療12周后，兩組患者肝功能AST、ALT、GGT水平明顯降低(P<0.01)；且觀察組治療后AST、ALT、GGT水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表1。

表1 兩組肝功能比較

2.兩組LDL-C、TC、TG、HDL-C比較：治療12周后，兩組HDL-C明顯升高，LDL-C、TC和TG明顯降低(P<0.01)；且觀察組患者治療12周后 LDL-C、TC和TG少于對照組，HDL-C高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表2。

表2 兩組LDL-C、TC、TG、 HDL-C比較

3.兩組肝臟酶學療效比較：治療12周后，觀察組總有效率為94.23%，顯著多于對照組(76.92%,χ2=4.986，P<0.05)，詳見表3。

表3 兩組肝臟酶學療效比較[n(%)]

4.兩組外周血Th17和Treg細胞水平比較：治療12周后，兩組患者外周血Th17細胞、Treg細胞以及Treg/Th17比值顯著減少(P<0.01)；且觀察組治療12周后外周血Th17細胞、Treg細胞以及Treg/Th17比值少于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表4。

表4 兩組外周血Th17和Treg細胞水平比較

5.兩組腸道菌群比較：治療12周后，兩組患者的雙歧桿菌、乳酸桿菌水平顯著升高，大腸桿菌明顯減少(P<0.01)，且觀察組患者的雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著高于對照組，大腸桿菌明顯低于對照組(P<0.01)；兩組治療前腸球菌水平變化比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表5。

表5 兩組腸道菌群比較拷貝數/克)

討 論

非酒精性脂肪性肝病是臨床常見慢性肝病之一，患者常合并代謝綜合征，與胰島素抵抗、肥胖、遺傳易感等密切相關，但其發病機制尚待闡明。目前現代醫學普遍認為“二次打擊”學說是非酒精性脂肪性肝病發生、發展的主要機制之一，初次打擊為脂質代謝紊亂和胰島素抵抗導致體內的肝細胞脂質沉積形成單純性脂肪肝；第2次打擊為多種因素誘發氧化應激、脂質過氧化損害，從而損傷肝臟以及導致肝細胞變性、壞死，形成脂肪性肝炎[10,11]。

鹽酸小檗堿通過興奮胰島素受體mRNA轉錄以及蛋白激酶C依賴激活啟動子增加胰島素受體基因表達，促進胰島素受體的生成，進而增加胰島素的敏感度；同時也通過抑制線粒體和激活腺苷酸活化蛋白激酶，下調肝糖異生基因以及脂肪合成基因，調節異常脂質代謝，達到降血脂、血糖的作用[12,13]。甘草酸二銨腸溶膠囊為甘草酸二胺和磷脂酰膽堿的新型復合物，甘草酸二胺有較強的抗炎、保護肝細胞及改善肝功能的作用；磷脂與肝細胞膜有較高的親和性，可維持細胞膜的流動性、保護肝細胞膜，磷脂中的膽堿對脂肪有一定的親和力，可有效降低血清甘油三酯、膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇[14]。甘草酸二銨與磷脂結合以后，脂溶性明顯增高，生物利用度也明顯增加，產生協同效應，臨床可用于治療急、慢性病毒性肝炎等所引起的肝功能異常，亦能降低非酒精性脂肪性肝病患者的轉氨酶及血脂升高[15]。

本研究結果顯示，治療12周后，觀察組治療后AST、ALT、GGT水平以及LDL、TC和TG低于對照組，HDL-C高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，提示鹽酸小檗堿片聯合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病可促進患者肝功能和血脂水平好轉。治療12周后療效統計發現，觀察組總有效率為94.23%，顯著多于對照組(76.92%)，說明鹽酸小檗堿片聯合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病的療效更佳，值得臨床借鑒。

非酒精性脂肪性肝病的“二次打擊”學說認為免疫系統激活是第2次打擊的主要參與因素之一，其中免疫微環境的改變是其重要病理特征，與免疫炎性細胞因子失衡有關[16]。Th17細胞均為CD4+淋巴細胞亞群，其主要分泌或誘導白細胞介素、腫瘤壞死因子-α 等促炎性細胞因子，介導炎性反應，造成肝組織損害[8]。Treg細胞也是CD4+淋巴細胞亞群之一，可通過分泌轉化生長因子-β以及細胞直接接觸，并作為抗原呈遞細胞的各種免疫細胞發揮直接作用，促進肝臟發生纖維化[17]。Th17細胞、Treg細胞相互作用，在生理狀態下保持平衡以維持機體免疫內環境的穩定。唐濤等[18]研究發現，非酒精性脂肪性肝病患者外周血中Th17和Treg細胞在T 淋巴細胞中的比例均顯著升高并且Th17/Treg的比例也明顯增加，與胰島素抵抗存在一定的相互作用，參與了非酒精性脂肪性肝病的發生、發展過程。本研究觀察組外周血Th17細胞、Treg細胞以及Treg/Th17比值明顯少于對照組，提示鹽酸小檗堿片聯合甘草酸二銨腸溶膠囊可能通過調節Th17/Treg細胞對非酒精性脂肪性肝病起到一定治療作用。

腸道與肝臟在結構與功能上存在解剖學、病理生理聯系，腸道菌群的紊亂是非酒精性脂肪性肝病的病理機制之一。腸道有害細菌過多及益生菌減少，引起有害代謝物質產生過多，并進入肝臟導致肝臟炎性反應、氧化應激等，形成肝脂肪變性和纖維化；肝臟疾病患者的腸道菌群營養底物、膽汁分泌以及腸道內膽鹽不足，門靜脈回流受阻，導致胃腸道淤血內積，肝臟分泌大量炎性因子，加重腸道菌群失衡[19]。易艷容等[20]研究顯示，非酒精性脂肪性肝病患者的腸道有益菌雙歧桿菌及乳桿菌數量顯減少，有害菌腸桿菌和腸葡萄球菌數量明顯增加，使腸源性內毒素增多，引起炎性介質的大量釋放，進一步損害肝細胞。本研究結果顯示，觀察組的雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著高于對照組，大腸桿菌明顯低于對照組。朱超霞等[21]研究發現，小檗堿可能通過改善腸道菌群的結構和減輕高脂飲食所致腸道黏膜損傷，對高脂飲食所誘導的非酒精性脂肪性肝病發揮治療作用。提示鹽酸小檗堿片聯合甘草酸二銨腸溶膠囊通過調節腸道菌群紊亂可能是其治療非酒精性脂肪性肝病的有效途徑之一。

綜上所述，鹽酸小檗堿片聯合甘草酸二銨腸溶膠囊治療非酒精性脂肪性肝病可促進患者肝功能和血脂水平的改善，提高療效，調節Th17Treg細胞失衡和改善腸道菌群紊亂可能與上述治療效果有關。