基于PCR-毛細管電泳法對1例5結節肝細胞癌克隆起源的檢測分析

朱玉瑤 陳佳 叢文銘

（海軍軍醫大學附屬上海東方肝膽外科醫院病理科 上海 201805）

原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），是我國常見的肝臟惡性腫瘤，本課題組曾較早開展了多結節性HCC克隆特點研究，提出了單克隆（IM型）和多克隆（MO型）兩大起源模式[1-2]。IM型是指肝內殘留癌細胞的復燃生長，而MO型本質上為一個新生肝臟腫瘤。本研究采用熒光PCR-毛細管電泳技術檢測了周邊肝組織及HCC的5個獨立結節，分析周邊肝組織與腫瘤組織各個結節的克隆起源。

1.材料與方法

1.1 樣本信息

選取海軍軍醫大學東方肝膽外科醫院收治一例原發性肝癌標本，因體檢發現甲胎蛋白386.5ng/ml，CT提示肝左葉占位，行“左肝部分切除術”。

1.2 微衛星位點選擇：

根據文獻與HCC克隆起源相關的基因，以及腫瘤發生發展相關的抑癌基因，選取了10個微衛星位點進行檢測，并采用不同熒光標記對引物進行標記[3]。位點信息為如 下：FAM標 記 的D8S520、D16S514、D8S246、D16S419、D1S507、D17S831、D13S268，HEX標記的D1S243、D17S938、D16S505。

1.3 PCR-CE實驗方法

采用PCR-毛細管電泳法檢測分析克隆起源，PCR反應參照zhao等的報道[4]，最后在ABI 3500測序儀上進行毛細管電泳。

1.4 結果判斷方法

結果判讀方法參照zhao等的報道[4]。

2.結果

2.1 病理結果

肝臟標本14×8×5cm，切面見5個灰白色腫物（T1-T5），直徑1～2.5cm，病理診斷：5結節均為肝細胞癌，硬化型，Ⅲ級。

2.2 免疫組化結果

5個結節免疫組化染色結果基本相同，HePar-1（-），Arginse（-），CK7（+），GPC-3（+），HBsAg（+）。

2.3 克隆起源檢測結果

通過上述方法對HCC的5個結節（T1-T5）進行克隆起源檢測，結果為：與正常組織（N）相比，腫瘤組織在10個微衛星位點處存在缺失（圖1）；5個結節之間進行比較，結節T2和另外4個結節均檢出了3個或以上的等位基因缺失，提示結節T2與其他4個結節為不同克隆來源，結節T1,T3-T4之間出現了≤2個等位基因缺失，提示該4個結節為相同克隆來源。

3.討論

一般認為多結節HCC的發生主要有3種可能，第一種是肝內種植轉移（intrahepatic metastasis，IM型），與原發腫瘤為相同克隆來源，即克隆起源；第二種是不同部位的肝細胞在慢性肝炎或肝硬化背景下，因持續受到HBV/HCV感染刺激，形成新的腫瘤（multicentric occurrence，MO型），與原發腫瘤為不克隆來源，即多克隆起源[3]；第三種為以上兩種情況兼有之。

克隆起源模式難以通過臨床表現和病理的組織形態學判別，即便是在同一個患者中也可能同時存在IM和MO，通過PCR-毛細管電泳法檢測腫瘤樣本各結節中的10個微衛星位點的長度，能夠揭示腫瘤細胞克隆起源的特征[5]。本例中與正常組織相比，5個腫瘤在10個位點中都有缺失，證明在此微衛星區域很有可能存在和腫瘤發生相關的抑癌基因。因此對于多結節性HCC進行克隆起源檢測能夠對其生物學特性有更加全面的認識。