醒腦靜對大鼠腦出血病灶周圍星形膠質細胞表達水通道蛋白-4的影響研究*

趙志靖，第五飛虎，鄧毅恒，楊利孫

長安醫院神經外科(西安 710016)

腦出血(Intracerebral hemorrhage,ICH)是嚴重危及廣大人民健康與生活的臨床常見危重病與多發病，其繼發性腦水腫是明顯影響患者轉歸的重要因素之一[1]。基礎和臨床研究提示，醒腦靜能促進腦出血后患者蘇醒，縮短昏迷時間，減少并發癥發生，目前其機制仍未明確[2]。水通道蛋白-4(AQP-4)主要分布在腦組織，分布于星形膠質細胞、腦表面的軟腦膜、腦室系統的室管膜等，在維持大腦水平衡發揮重要作用，目前國內外極少探討醒腦靜相互作用與其機制如何的相關研究。本實驗旨在利用動物與細胞實驗共同探討醒腦靜對大鼠腦出血病灶周圍星形膠質細胞表達AQP-4的作用效果，以期進一步闡明醒腦靜減輕腦出血動物模型腦水腫的原理，為臨床應用提供參考。

材料和方法

1 材 料 成年雄性清潔級SD大鼠60只，體質量(250±30)g，購自空軍軍醫大學實驗動物中心[SCXK(軍) 2012-0007]。醒腦靜注射液(國藥準字Z32020563)購自無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司。大鼠星形膠質細胞株(R1800)購自上海中喬新舟生物科技有限公司。AQP-4抗體(兔抗鼠)購自美國ABCAM公司，山羊抗兔二抗、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)購自美國THERMO FISHER公司。總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自美國PROMEGA公司。胎牛血清、丙酮酸鹽溶液、DMEM培養基均購自美國THERMO FISHER公司。

2 研究方法

2.1 動物模型的建立與分組:參考文獻所述方法[3]，采用膠原酶VII定位注射誘發大鼠尾殼核腦出血模型。實驗前一周實驗大鼠均接受平衡木訓練。使用異氟烷氣體麻醉大鼠，固定于立體定位儀，暴露實驗鼠前囟后1 mm，正中線旁開3 mm處(尾殼核定位處)鉆開顱骨，微量注射器注射0.6 U膠原酶VII/3 μl生理鹽水，深度為5 mm，注射速度為1 μl/min。注射后停留10 min退針。術后6 h后用Longa FZ評分法進行行為學評分，具體如下：0分，無體征；1分，不能完全伸展進針對側肢體(左側)；2分，進針對側肢體癱瘓，向進針對側轉圈，有追尾現象；3分，不能站立向進針對側傾倒；4分，有意識障礙。評分達2分以上加上病理學證據可認為模型成功。造模失敗補齊動物并重新造模。

將造模成功大鼠按照隨機數字表法分為醒腦靜治療組與對照組，給藥方法如下：分組后給藥一次，醒腦靜治療組大鼠給予腹腔注射醒腦靜注射液2 ml/kg，對照組大鼠給予腹腔注射等容量生理鹽水。治療72 h后予以處死取材，處死前進行行為學評分，兩組各隨機選組20只大鼠腦實質組織提取總蛋白或總RNA后至于-70℃冰箱保存，其余均用來作腦含水量測定。

2.2 行為學觀察:參考文獻所述方法，利用平衡木評分法對治療72 h后兩組大鼠進行評估，以其觀察兩組大鼠行為學變化。讓大鼠通過升高的平衡木，進入較暗的飼養箱。評分標準如下：0分，能跳上平衡木，在上面行走不會跌倒；1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會少于50%；2分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會大于或等于50%；3分，在健側后肢的幫助下能跳上平衡木，但受累癱瘓側后肢不能幫助向前移動；4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分，將大鼠放在平衡木上會掉下來。3次測試結果的平均分作為最后成績。

2.3 腦實質含水量測定：采用干濕質量法，術后48 h即處死兩組大鼠進行取材，首先將兩組實驗大鼠腦組織完整組織稱濕重，然后放入恒溫電烤箱內，上調溫度至120℃，持續8 h，稱取干質量。利用公式：腦含水量=(濕質量-干質量)/濕質量×100%進行計算。

2.4 腦實質組織學觀察:制備常規標本，進行HE染色，光鏡下觀察；制備電鏡標本，經半薄切片定位制成超薄切片，在透射電鏡下觀察。

2.5 細胞培養及實驗分組:細胞株(R1800)用含10%FBS的DMEM培養基(完全培養液)置于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育，當細胞貼壁90%時，用胰酶進行消化傳代。首先調整細胞密度，實驗前24 h，按照密度1.5×105/cm2接種細胞到預先包被多聚賴氨酸的細胞培養板，15 min后將上清去掉，更換為新鮮含血清培養基，并置于環境調節為37℃、5%CO2細胞培養箱中進行孵育培養。分組處理：①5 ml/L醒腦靜組，培養基中添加5 ml/L醒腦靜注射液；②10 ml/L醒腦靜組，培養基中添加10 ml/L醒腦靜注射液；③20 ml/L醒腦靜組，培養基中添加20 ml/L醒腦靜注射液；④對照組，單純含體積分數的10%FBS。培養基中培養7 d，提取總蛋白或總RNA后至于-70℃冰箱保存。

2.6 蛋白免疫印跡:將實驗中提取的組織或細胞蛋白以100 g/L SDS-PAGE電泳分離，行轉膜后，室溫封閉，分別加入AQP-4(兔抗，1∶1000)，冰箱4℃行孵育。過夜后，進行徹底洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶2500)孵育2 h，再次進行洗膜，用增強化學發光法顯色、顯影，凝膠成像分析系統攝像分析，以β-actin為內參。

2.7 逆轉錄PCR:將提取的組織或細胞總RNA，逆轉錄得到相應的cDNA，以該cDNA為模板，采用逆轉錄PCR法檢測AQP-4的轉錄水平，以β-actin為內參。引物由空軍軍醫大學西京醫院肝膽外科實驗設計，由上海生工公司合成。

結 果

1 兩組大鼠生存率、行為學評分及腦實質含水量的差異 對照組大鼠死亡8只，生存率為73.33%，醒腦靜治療組大鼠死亡例數為2只，生存率為93.33%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。平衡木行為學評分法對兩組大鼠行為學進行評價，對照組評分為(4.60±0.34)分，醒腦靜治療組評分為(2.63±0.39)分，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。如圖1所示，所有大鼠造模后均顯示腦實質尾狀核出血。對照組大鼠腦組織含水量(80±0.510)%，醒腦靜治療組大鼠腦組織含水量(77±0.351)%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2 兩組大鼠腦組織超微結構的差異 兩組大鼠腦組織常規HE染色，光鏡下可見兩組大鼠腦實質中可見血腫，且血腫周圍組織腫脹，細胞呈氣球樣變、壞死，炎性細胞浸潤以中性粒細胞為主。相對于對照組，醒腦靜治療組間質水腫和炎性細胞浸潤明顯減輕。透射電鏡觀察顯示，對照組大鼠腦實質中星形膠質細胞胞體增大，呈氣球樣變，胞質疏松分散，細胞器減少，細胞核增大，可見部分細胞核體腫脹，少數細胞表現為壞死，醒腦靜治療組均未發現類似表現(圖2)。

3 兩組大鼠腦實質AQP-4蛋白及mRNA表達的差異 醒腦靜治療組大鼠腦組織AQP-4蛋白表達量顯著高于對照組表達量，兩組比較差異有統計學意義。同樣，醒腦靜治療組大鼠腦組織AQP-4 mRNA表達量顯著高于對照組表達量，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05圖3)。

4 醒腦靜對星形膠質細胞表達AQP-4蛋白及mRNA的影響 相對于對照組，5 ml/L醒腦靜可上調AQP-4蛋白及mRNA的表達，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且隨著醒腦靜濃度遞增，AQP-4蛋白及mRNA的表達也呈現遞增，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05圖4)。

討 論

由于血腦屏障的破壞，腦出血后首先出現的為血管源性腦水腫，隨著細胞代謝障礙，繼發出現的細胞毒性腦水腫起主導作用，最終導致顱內壓明顯升高危及患者生命。目前研究認為，炎癥因子釋放、激活相應的信號通道與腦出血后病灶周圍組織水腫的發生密切相關[4-7]。醒腦靜注射液屬于中成藥，是由安宮牛黃丸所改成的水溶性的注射液，主要有麝香、郁金、冰片等中藥成分提取而成。已有的研究表明醒腦靜對于清除血腦屏障及自由基，尤其對患者血清中的腫瘤壞死因子、白介素-6、白介素-8等炎癥因子具有抑制作用，從而達到保護腦水腫區域腦細胞的重要作用[8]。本研究采用膠原酶VII定位注射誘發大鼠尾殼核腦出血模型，給模型大鼠腹腔分別注射醒腦靜與等容量的生理鹽水，造模72 h后，醒腦靜治療組大鼠生存率為93.33%，明顯高于對照組，經醒腦靜治療后的腦出血大鼠在肢體對稱平衡方面也得到改善，醒腦靜治療組評分為(2.63±0.39)分，對照組評分為(4.60±0.34)分，兩組比較差異有統計學意義。進一步組織學觀察發現，在光鏡下，相對于對照組，醒腦靜治療組間質水腫和炎性細胞浸潤明顯減輕。透射電鏡觀察顯示，對照組大鼠腦實質中星形膠質細胞胞體增大，呈氣球樣變，胞質疏松分散，細胞器減少，細胞核增大，可見部分細胞核體腫脹，少數細胞表現為壞死，醒腦靜治療組均未發現類似表現。體內實驗顯示，醒腦靜治療可減輕腦出血后周圍組織腦水，提高模型大鼠的生存率，改善模型大鼠肢體對稱平衡。

星形膠質細胞是中樞神經系統數量最多的細胞，它參與血腦屏障的構成，在腦實質中，星形膠質細胞與血管內皮細胞關系密切，研究表明，星形膠質細胞在血管源性腦水腫的發生、發展以及消退中起重要作用[9-12]。腦組織中水通道蛋白主要為AQP-4，其在腦內主要集中在腦室系統的室管膜、腦表面的軟腦膜、星形膠質細胞等，是星形膠質細胞、腦脊液以及血管之間的水調節和運輸的重要通道蛋白，調節腦脊液重吸收、腦細胞滲透壓水平等，在維持大腦水平衡發揮重要作用[13-14]。目前研究顯示，若AQP-4基因被敲除，即可誘發實驗動物發生血管源性腦水腫[15-16]。腦出血后首先表現的為血管源性腦水腫，本研究發現，模型大鼠腦組織表達AQP-4mRNA及蛋白均明顯下降，同樣支持AQP-4功能缺失參與血管源性腦水腫的發生。本實驗顯示，醒腦靜通過刺激模型組大鼠腦實質AQP-4mRNA及蛋白的表達，減輕腦出血后腦水腫的程度，從而改善模型大鼠的生存率及肢體對稱平衡。

腦出血后血腦屏障破壞，滲出到血管外的血液成分、凝血酶、血清等均參與血管源性腦水腫的形成。目前研究發現，含血清培養可導致星形膠質細胞發生細胞水腫。在本研究中發現，加入10%FBS后，在倒差顯微鏡下可發現星形膠質呈氣球樣變，細胞胞體增大，胞質疏松，細胞核增大，甚至部分細胞核核體腫脹破裂。培養基中加入醒腦靜注射液，倒差顯微鏡下觀察可見星形膠質細胞胞質濃縮，破裂細胞核明顯減少。進一步蛋白免疫印跡及逆轉錄PCR發現，隨著加入培養基中醒腦靜濃度增加，星形膠質細胞AQP-4mRNA及蛋白的表達均明顯上升，兩組比較差異有統計學意義，顯示醒腦靜可通過上調AQP-4表達，緩解細胞水腫的發展，然而其具體誘導途徑尚需進一步深入研究。

綜述所述，本研究采用膠原酶VII定位注射誘發大鼠尾殼核腦出血模型，證實了經醒腦靜治療后的腦出血大鼠無論在生存率還是在肢體對稱平衡方面均得到改善，其機制可能是醒腦靜可直接刺激星形細胞上調AQP-4蛋白及mRNA的表達，從而緩解腦出血后血管源性腦水腫的進展，這為未來醒腦靜用于治療腦出血后腦水腫治療提供新的理論支持。