長鏈非編碼RNA-LncRNA小核仁RNA宿主基因14對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響

劉淳 林順歡 賈筠 關靈 鄭銳年 林欽雄 劉克軍袁惠玲 葉偉標 廖玉婷

南方醫科大學附屬東莞市人民醫院1腫瘤內科，2臨床研究中心，3乳腺科，4病理科（廣東東莞523000）

乳腺癌占女性所有腫瘤的29%，是中國和世界范圍內女性最常見的惡性腫瘤［1］。雖然近年來對于乳腺癌的診斷和治療方法取得了很大進展，但乳腺癌患者的5年生存率仍然較低，由于乳腺癌轉移率高，且目前其發病和轉移的機制尚未完全清楚［2］，因此，深入探討乳腺癌的分子機制對乳腺癌的診斷和治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）是長度超過200 nt 的RNA，其參與腫瘤的多種生物學行為［3］。既往研究表明，LncRNA-NORAD 可被YAP 途徑抑制并通過隔離S100P 抑制乳腺癌的轉移［4］。而LncRNA-sONE 可通過誘導miR-34a、miR-15a、miR-16 和let-7a 的表達來抑制三陰性乳腺癌侵襲性［5］。研究表明，LncRNA 小核仁RNA 宿主基因14（small nucleolar RNA host gene 14，SNHG14）一種關鍵的LncRNA，LncRNA-SNHG14 在多種腫瘤中差異表達，通過海綿狀miR-203 促進細胞腎細胞癌遷移和侵襲［6］。且LncRNA-SNHG14 可通過吸附miR-92a-3p 抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲，促進腫瘤細胞凋亡［7］。也有研究顯示LncRNA-SNHG14 通過吸附miR-340 從而在非小細胞肺癌中發揮致癌功能［8］。因此，LncRNA-SNHG14 在不同腫瘤中具有差異的生物學功能，目前對于LncRNA-SNHG14 在乳腺癌中的表達和對腫瘤細胞生物學功能的影響仍未明確。本研究旨在探討LncRNA-SNHG14 在乳腺癌組織中的表達水平，及其對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響和潛在機制。

1 資料與方法

1.1 組織收集收集于2018年1月至2019年1月在我院行手術治療的乳腺癌組織和癌旁組織共40例，其中腫瘤分期Ⅰ期12 例、Ⅱ期13 例、Ⅲ期11例、Ⅳ期4 例，組織學分級Ⅰ級16 例、Ⅱ級14 例、Ⅲ級10 例。所有患者在術前均未進行放療和化療。所有組織用無菌PSB 洗滌后，快速放入冷凍液氮，儲存在-80 ℃待測。本研究獲得醫院倫理委員會審核通過。

1.2 細胞培養和處理CAL51、BT474、HCC1954、HS578T、T-47D 人乳腺癌細胞，以及正常乳腺上皮細胞株MCF-10A 購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，培養基由10%胎牛血清（FBS；Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA），Dulbecco改良的Eagle 培 養基（DMEM）（Gibco、Rockville，MD，USA）組成。細胞置于含有5%CO2的37 ℃培養箱中培養。

1.3 細胞轉染合成了針對LncRNA-SNHG14 的表達短發夾RNA（shRNA）的慢病毒，具體靶向序列為5′-GCAACATTCCCTGAACATACT-3′（shRNA#1）和5′-GCGAGGAATCTGATTCCAAGC-3′（shRNA#2）的shRNA 連接到pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA載體，并通過包裝病毒質粒包裝成慢病毒，具體操作由和園生物技術公司（上海）進行。然后將LncRNA-SNHG14 的shRNA 和空載對照（對照）的慢病毒用于CAL51 乳腺癌細胞中的轉染。轉染48 h后，并采用嘌呤霉素（5 μg∕mL）篩選穩轉細胞株14 d 后，使用RT-qPCR 檢測細胞中LncRNA-SNHG14 的表達水平。

1.4 RNA 提取和RT-qPCR用TRIzol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分離組織和細胞中的總RNA。使用TRIzol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）分離總RNA。通過逆轉錄試劑盒（TaKaRa Biotechnology Co.，Ltd.，Dalian，China），然 后從總RNA 逆轉錄互補的脫氧核糖核酸（cDNA）。RTqPCR 條件如下：在95 ℃，5 min；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，總共35 個循環。RT-qPCR 引物：SNHG14，正向：5′-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3′，反向：5′-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3′，β-actin，正向：5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′和反向：5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。用ABI 7500 進行qRT-PCR 測定（Invitrogen），has-miR-144，正向：5′-GGGAGATCAGAAGGTGATT-3′，反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，通過2-ΔΔCt法計算LncRNASNHG14 在乳腺癌組織中或細胞中的表達水平。

1.5 細胞增殖檢測通過CCK-8 法測定（Dojindo，Kumamoto，Japan）每24 小時監測96 孔板中乳腺癌細胞的細胞增殖水平。CCK-8 試劑孵育60 min 后，采用分光光度計（Thermo Scientific，Rockford，IL，USA）測量450 nm 處的吸光度。并通過克隆形成實驗檢測乳腺癌細胞的增殖水平，具體將處于對數生長期的乳腺癌細胞約500 個接種到6 孔板，培養20 d 后，固定后采用結晶紫染色于顯微鏡下觀察計數。

1.6 細胞侵襲和遷移實驗Transwell 侵襲實驗：8 μm 孔徑的Transwell 小室（Corning，NY，USA）進行。 將150 μL 無血清DMEM 中的4×104個細胞鋪到含有50 μg 基質膠（BD，Bedford，MA，USA）的Transwell 小室的上室中。下室加入600 μL 的10%FBS+DMEM。48 h 后，將室的頂部表面用預冷的甲醇浸沒10 min，并用結晶紫染色30 min，統計遷移入下室的乳腺癌細胞。細胞遷移實驗則不采用基質膠讓腫瘤細胞遷移8 h。

1.7 結合位點和預后分析采用starBase V3.0（http：∕∕starbase.sysu.edu.cn∕）預 測SNHG14 結 合 的miRNA，并通過Kaplan Meier plotter（http：∕∕kmplot.com∕analysis∕）工 具 分析miRNA 與 乳 腺 癌預 后的關系。

1.8 熒光素酶測定將SNHG14 的3′-UTR 克隆到pGL3 載體（Promega，Madison，WI，USA）中作為野生型（WT）3′-UTR。通過快速變化的定點誘變試劑盒（Stratagene，La Jolla，CA，USA）進行SNHG14 3′-UTR 中作為has-miR-144 結合位點的進行突變（MUT）。然后，它們用于轉染CAL51 細胞。采用熒光素酶測定在雙熒光素酶的表達。

1.9 Western Blot 檢測采用RIPA 裂解細胞蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，在SDS-PAGE 凝膠電泳分離并轉膜，4 ℃孵育一抗過夜，Rabbit Anti-CEP55抗體（ab170414）和Anti-beta Actin（ab227387）抗體均購自abcam。采用HRP 標記二抗孵育1 h后，采用ECL 法進行顯影，圖像采集后采用Image J軟件進行分析。

1.10 統計學方法采用Graphpad prism 7.0 軟件進行統計分析。數據以均數± 標準差表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用SNK 法檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和細胞系中LncRNA-SNHG14 的表達水平分析40 例乳腺癌腫瘤組織和癌旁組織對比中，其中腫瘤組織的LncRNA-SNHG14 的表達水平平均為（3.62±0.74）倍數變化，顯著高于癌旁組織，差異具有統計學意義（P＜0.001，圖1A）；而CAL51、BT474、HCC1954、HS578T、T-47D 人乳腺癌細胞系的LncRNA-SNHG14 的表達水平均顯著高于正常的乳腺上皮細胞株MCF-10A，其中CAL51的表達水平最高，為（9.22 ± 0.45）倍數變化（圖1B）。腫瘤分期為Ⅲ、Ⅳ期的LncRNA-SNHG14 的表達水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期，且腫瘤組織學分級Ⅲ級的LncRNA-SNHG14的表達水平顯著高于Ⅰ級和Ⅱ級，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖1C、1D）。

2.2 敲低LncRNA-SNHG14 表達對乳腺癌細胞增殖的影響采用慢病毒敲低CAL51 細胞系的LncRNA-SNHG14表達后，RT-qPCR結果顯示shRNA#1的敲低效率最高（圖2A）。CCK-8 檢測結果顯示敲低LncRNA-SNHG14 表達后24、48 和72 h，CAL51細胞的活性顯著低于對照組，差異具有統計學意義（P＜0.05，圖2B）；克隆形成實驗結果顯示shRNA#1 的CAL51 細胞系其克隆形成數顯著低于對照組（P＜0.05，圖2C、2D）。

圖1 乳腺癌組織和細胞系的LncRNA-SNHG14 表達水平Fig.1 LncRNA-SNHG14 expression levels in breast cancer tissues and cell lines

2.3 LncRNA-SNHG14 對乳腺癌細胞侵襲和遷移的影響敲低LncRNA-SNHG14 后，CAL51 細胞的侵襲和遷移到下室的細胞數顯著減少（P＜0.001，圖3），表明敲低LncRNA-SNHG14 后乳腺癌細胞的侵襲和遷移能力均顯著下降。

圖2 LncRNA-SNHG14 表達對乳腺癌細胞增殖的影響Fig.2 Effect of LncRNA-SNHG14 expression on proliferation of breast cancer cells

圖3 LncRNA-SNHG14 對乳腺癌細胞侵襲和遷移的作用Fig.3 Effect of LncRNA-SNHG14 on invasion and migration of breast cancer cells

2.4 LncRNA-SNHG14 在乳腺癌細胞中與hasmiR-144 的關系采用starBase V3.0 預測到LncRNA-SNHG14 可以與miR-144 相結合，且has-miR-144 能靶向降解中心體蛋白55（centrosomal protein 55，CEP55）（圖4A），敲低LncRNA-SNHG14后CAL51的miR-144的表達量顯著上調（圖4B），且熒光素酶和RNP 檢測試驗明確了LncRNA-SNHG14 可以與miR-144 相結合（圖4C）。Kaplan Meier plotter 結果顯示miR-144低表達乳腺癌患者總體生存率顯著下降（圖4D）。敲低LncRNA-SNHG14 后CAL51 細胞CEP55的表達水平顯著下降（圖4E、4F）。

圖4 LncRNA-SNHG14 與miR-144 和CEP55 的關系Fig.4 Relationship between LncRNA-SNHG14 and miR-144 and CEP55

3 討論

大量研究表明LncRNAs 是乳腺癌增殖和轉移的重要調節因子。LncRNA SNAR 可以促進乳腺癌細胞的增殖和轉移，可能是新的治療靶點［9］。LncRNA UCA1 在乳腺癌中起著致癌基因的作用，通過靶向miR-143 調節細胞增殖和凋亡［10］。LncRNA LINP1 可促進DNA 雙鏈斷裂的修復，并提高乳腺癌細胞對放療的敏感性［11］。因此，探討LncRNAs 在乳腺癌中的作用對乳腺癌的病理生理機制提供了新的機遇和治療方向。最近研究［12］表明LncRNA-SNHG14在腫瘤發生的進展中起重要作用。本研究的結果初步明確了LncRNA-SNHG14在乳腺癌組織和乳腺癌細胞中表達顯著上調。此外，沉默LncRNA-SNHG14 后顯著抑制了乳腺癌細胞的增殖和遷移，進一步明確了LncRNA-SNHG14可以吸附miR-144 從而調節CEP55 的表達以發揮其作用。表明LncRNA-SNHG14 是調節乳腺癌細胞增殖和遷移的重要因子。

本研究首先明確了SNHG14 在乳腺癌組織和細胞系中顯著高表達，并且抑制SNHG14 可以顯著抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移作用。表明SNHG14 可以調節乳腺癌細胞的生長和轉移。既往研究［13］顯示LncSNHG14 促進膀胱癌的發生和進展，SNHG14 的過表達加速了增殖潛能和細胞周期進程。且SNHG14 在宮頸癌中可以顯著抑制細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡［14］，這表明了SNHG14 在多種腫瘤中均有調節細胞增殖和轉移的作用。

探討SNHG14 在乳腺癌中促進其增殖和轉移作用的機制，筆者首先發現了SNHG14 可以吸附miR-144，從而間接調節了CEP55 的表達。CEP55作為微管-成束蛋白，其可在間期細胞的中心體中發現，并在細胞周期調節中起重要作用［15］。既往研究［16］表明CEP55 可以促進細胞周期發生變化，是細胞周期的生物標志物，且CEP55 在乳腺癌中顯著高表達。同時，miR-144 可以同靶向CEP55 而抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲，具體是通過誘導細胞周期阻滯和通過抑制CEP55 的表達促進了乳腺癌細胞凋亡。本研究中采用Kaplan Meier plotter 預測到了miR-144 低表達乳腺癌患者預后顯著不良，而敲低SNHG14 后乳腺癌細胞miR-144的表達顯著升高，而CEP55 的表達水平顯著下降，表明了SNHG14 是通過靶向吸附miR-144，進一步介導CEP55 表達上升的信號軸發揮了對乳腺癌增殖和遷移的促進作用。

對于SNHG14 對乳腺癌的體內作用以及其調節miR-144 的具體機制，仍需要進一步深入研究。綜上所述，LncRNA-SNHG14 在乳腺癌組織和細胞中高表達，LncRNA-SNHG14 可通過miR-144∕CEP55 信號軸從而促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。LncRNA-SNHG14 有望成為治療乳腺癌的重要靶點。