p53蛋白O-乙酰氨基葡萄糖修飾介導宮頸癌細胞的順鉑耐藥

王漪 陳必良

空軍軍醫大學第一附屬醫院西京醫院婦產科（西安710032）

癌細胞營養消耗增高導致細胞代謝失調是腫瘤的重要特征。在腫瘤細胞中，氨基己糖合成途徑代謝異常活躍，利用葡萄糖、谷氨酰胺、乙酰輔酶A 和尿苷三磷酸最終生成尿苷二磷酸乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc）［1］。進一步的，在β-N-乙酰葡萄糖胺糖基轉移酶（O-GlcNActransferase，OGT）作用下，將O-乙酰氨基葡萄糖（O-linked-β-Nacetylglucosomaine，O-GlcNAc）從UDP-GlcNAc 轉移至蛋白質的絲氨酸或蘇氨酸殘基，導致一種蛋白翻譯后修飾，稱為O-GlcNAc 糖基化修飾［2］。另一方面，β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷水解酶（O-GlcNAcase，OGA）負責將蛋白質O-GlcNAc 糖基化移除。O-GlcNAc 糖基化修飾在腫瘤發生、發展中的作用越來越多的被報道。近來研究［3］發現，在乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌和肺癌中，O-GlcNAc 糖基化水平均明顯升高。O-GlcNAc 糖基化可以促進胰腺癌細胞增殖，并能夠增強乳腺癌細胞的侵襲和轉移［4-5］。除此之外，在肺癌中，O-GlcNAc 糖基化水平升高能夠促進腫瘤的生長［6］。有報道［7］顯示，原癌基因和抑癌基因的O-GlcNAc 糖基化修飾在促進腫瘤生長中也發揮了重要作用，如p53。已有研究［8］顯示，在宮頸癌細胞中高表達OGT 可導致癌基因蛋白E6 和E7 表達增加，而干擾OGT 表達則可抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和轉移。近來，有研究［9］顯示NF-κB 蛋白的O-GlcNAc 糖基化可以促進宮頸癌細胞的肺轉移，而抑制AMPK 的O-GlcNAc 糖基化則可導致宮頸癌細胞死亡［10-12］。因此，O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌細胞的增殖、侵襲和轉移，以及臨床耐藥性中可能發揮重要作用。盡管如此，作為一種重要的抑癌基因蛋白，p53 的O-GlcNAc 糖基化修飾與宮頸癌進展的關系，及其對宮頸癌細胞的增殖、凋亡和耐藥性的影響尚未有研究。因此，本研究旨在研究揭示p53 O-GlcNAc 糖基化水平與宮頸癌進展的關系，以及p53 O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌細胞增殖和凋亡，特別是順鉑抗性中的作用。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本收集本院宮頸癌I 期（CA I）臨床標本8 例，宮頸癌Ⅱ期（CAⅡ）標本8 例，宮頸上皮內瘤樣病變Ⅲ級（CINⅢ）標本8 例，宮頸癌旁組織（CON）標本8 例，-80 ℃保存，用于后續免疫組化和Western Blot 檢測。在患者知情同意下獲取臨床樣本，實驗獲得本單位倫理委員會審批支持（批件號KY20163089-1）。

1.2 細胞培養和處理人宮頸癌C-33A 細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，采用MEM-EBSS 培養基（Gibco，美國）培養，加入10%胎牛血清（Hyclone，美國）和1%青鏈霉素，37 ℃培養于5% CO2培養箱。細胞分為對照組（CON）、順鉑（DDP）處理組，順鉑和OGA 抑制劑TMG 處理組（DDP+TMG）、順鉑和OGT siRNA 干擾組（DDP+si-OGT）。順鉑（Biovision，美國）處理濃度50 μmol∕L，TMG（MCE，美國）濃度10 μmol∕L，均處理24 h。

1.3 siRNA 轉染人OGT 特異性siRNA 購買于Santa Cruz 公司（美國）。將C-33A 細胞接種于6 孔板，待細胞生長至60%～80%融合時進行siRNA 轉染。5 μL 的siRNA 加入100 μL 轉染培養基（Santa Cruz）混勻；另5 μL 的轉染試劑（Santa Cruz）加入100 μL 的轉染培養基混勻，將2 種液體混勻，室溫孵育45 min。用轉染培養基洗滌細胞，加入0.8 mL∕孔的轉染培養基，加入上述siRNA 混合液，37 ℃培養6 h 后換正常培養基，繼續培養24 h 后進行后續實驗。

1.4 免疫組化宮頸組織冰凍切片，厚度6 μm，室溫固定，蒸餾水漂洗后3% H2O2室溫孵育30 s。羊血清（中杉金橋，中國）室溫封閉1 h，滴加glycosylated p53 抗體（Detroit R&D，美國）（1∶100），4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗后，滴加生物素標記山羊抗小鼠二抗（1∶1000，碧云天，中國），37 ℃孵育1 h。PBS 沖洗后，DAB 顯色后封片。

1.5 Western Blot凍存的宮頸組織和細胞加入RIPA 裂解液（碧云天）裂解，20 000 g，4 ℃離心，收取上清蛋白。SDS-PAGE 凝膠電泳后，250 mA、100 min 轉至PVDF 膜。glycosylated p53 一抗（1∶1 000）、p53 一抗（1∶1 000，碧云天）、OGT 一抗（1∶1 000，Abcom，美國）和Cleaved Capase-3 一抗（1∶1 000，Abcom）4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）室溫孵育1 h。加入化學發光試劑，凝膠成像系統（Bio-Rad，美國）中曝光檢測。

1.6 細胞增殖采用CCK-8 試劑盒（同仁化學，日本）檢測細胞增殖。在細胞處理24 h 后，按照說明書進行細胞增殖檢測。

1.7 統計學方法數據表示為均數± 標準差。使用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，跟以Newman-Keuls分析檢測兩兩組間差異。以P值小于0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織中OGT 表達和p53 糖基化水平升高采用免疫組化檢測不同宮頸組織中p53 糖基化水平。由圖1A 可見，與癌旁組織相比，宮頸上皮內瘤樣病變Ⅲ級（CINⅢ）組織內已可見p53糖基化水平的明顯升高。宮頸癌組織內（CAⅠ，CAⅡ）p53 糖基化水平呈進一步增高趨勢，并隨著宮頸癌分期進展，p53 糖基化水平呈進行性增高。進一步地，western blot 結果顯示，與對照組相比，CINⅢ組織內OGT 表達已有顯著增加，而宮頸癌組織OGT 蛋白表達隨病理分期進展進行性升高（P＜0.05）（圖1B）。此結果表明，在癌前病變的CINⅢ級組織內，OGT 表達增加和p53 糖基化水平升高已經出現，宮頸癌組織內p53 糖基化水平與癌癥進展呈正相關，并可能源于OGT 表達增加導致的O-GlcNAc 糖基化。見圖1。

圖1 不同宮頸組織中p53 糖基化水平和OGT 表達變化Fig.1 The levels of p53 O-GlcNAcylation and OGT expression in different cervical tissues

圖2 TMG 所致p53 O-GlcNAc 糖基化介導宮頸癌細胞順鉑抗性Fig.2 p53 O-GlcNAcylation induced by TMG increased the resistance of cervical cancer cells to cisplatin

2.2 p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化引起宮頸癌細胞順鉑抗性增強采用OGA 特異抑制劑TMG 處理C-33A 細胞，抑制O-GlcNAc 糖基化去除活性，引起p53 O-GlcNAc 糖基化（gly-p53）水平升高（圖2A）。同樣，TMG 復合順鉑處理組（D+T）p53 糖基化水平較DDP 單獨處理組增高（圖2A）。DDP 處理引起C-33A 細胞caspase-3 剪切形式（Cl-Casp3）增加，而TMG 干預則降低了DDP 引起的caspase-3 剪切活化（圖2A）。此結果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化可拮抗DDP 導致的宮頸癌細胞凋亡。CCK-8 細胞活力檢測結果顯示，DDP 處理導致了宮頸癌細胞活力降低，TMG 復合處理則可逆轉順鉑引起的宮頸癌細胞活力降低（圖2B）。見圖2。

2.3 抑制p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化增強宮頸癌細胞順鉑敏感性為進一步明確O-GlcNAc 糖基化p53 在順鉑所致宮頸癌細胞凋亡中的作用，采用siRNA 對C-33A 細胞OGT 表達進行干擾。結果顯示，siRNA 干擾OGT（si-OGT）顯著降低了對照組和實驗組細胞p53 的O-GlcNAc 糖基化水平（圖3A）。DDP 處理顯著增加了宮頸癌細胞caspase-3 剪切體表達，而si-OGT 則進一步增強了DDP 所致的C-33A 細胞caspase-3 剪切活化（圖3A）。細胞活力檢測發現，si-OGT 引起了DDP 所致的細胞活力下降進一步降低（圖3B）。這些結果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化水平降低可增強DDP 對宮頸癌細胞的致凋亡作用。見圖3。

圖3 OGT 表達抑制降低p53 O-GlcNAc 糖基化并增強順鉑對宮頸癌細胞作用Fig.3 Inhibition of OGT decrease p53 O-GlcNAcylation and enhance effects of cisplatin on cervical cancer cells

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統最常見惡性腫瘤，位于女性最常見癌癥死因的第4 位［13］。手術清除輔助同步放化療是目前宮頸癌的標準治療方法，晚期宮頸癌的傳統治療策略是放療聯合順鉑化療［14］。順鉑是宮頸癌常用一線化療藥物，然而宮頸癌細胞容易對順鉑產生耐藥性，最終導致腫瘤復發，化療失敗［15］。因此，更深入理解化療時宮頸癌細胞凋亡抵抗的分子機制，有助于鑒別宮頸癌新的潛在治療靶點，改善治療效果。

近來，在多種腫瘤中均發現了O-GlcNAc 糖基化水平升高（hyper-O-GlcNAcylation），如乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、肝癌和肺癌，并在腫瘤發生和進展中發揮作用［3，16］。研究［9］顯示，多個分子的O-GlcNAc糖基化參與了腫瘤進展，如NF-κB 的O-GlcNAc 糖基化可促進宮頸癌細胞的肺轉移。此外，熱休克蛋白27（Hsp27）的O-GlcNAc 糖基化修飾可促使MCF-7 細胞的惡性轉化［17］作為重要的抑癌蛋白，p53 已被證實在卵巢細胞中可被O-GlcNAc 糖基化修飾調控，并參與卵巢癌細胞生長和周期調節［18］。然而，p53 在宮頸癌的表達，及其在宮頸癌發生發展中的作用尚未見報道。本研究發現，在宮頸癌組織中，p53 糖基化水平升高，并與宮頸癌病理分級呈正相關。OGT 表達的同步升高表明p53 O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌病情發展中可能發揮了重要作用。本研究結果提示了p53 O-GlcNAc糖基化和OGT 抑制作為宮頸癌臨床輔助治療的潛在可能。

O-GlcNAc 糖基化與腫瘤細胞的凋亡密切相關。在胰腺癌細胞中，高O-GlcNAc 糖基化顯示出抗凋亡特性，并使NF-κB持續保持高活性。另一個研究［19］顯示，在乳腺癌細胞中抑制OGT 活性，則可促進乳腺癌細胞的凋亡，表明高O-GlcNAc 糖基化阻止了乳腺癌細胞的凋亡。另一方面，O-GlcNAc糖基化還被證實可促進癌細胞增殖。腫瘤抑制因子FOXO3 的O-GlcNAc 糖基化引起了人胰腺癌細胞的異常增殖，這種促增殖作用源于FOXO3的O-GlcNAc 糖基化阻斷了p53 的調控作用［20］。在肝癌細胞中，β-連環蛋白（beta-catenin）發生O-GlcNAc 糖基化導致了肝癌細胞的增殖、克隆形成，并抑制了肝癌細胞凋亡［21］。p53 在細胞中發揮多種重要調控作用，如細胞周期進程、DNA 損傷反應、細胞衰老和誘導凋亡。本研究發現，p53 蛋白O-GlcNAc 糖基化導致了宮頸癌細胞凋亡減少和增殖能力升高，并可阻斷順鉑引起的宮頸癌細胞凋亡和增殖降低。與本研究結果一致，在肺癌細胞的研究也證實，肺癌細胞的順鉑抗性與O-GlcNAc糖基化p53 有關［2］。這些結果表明，p53 O-GlcNAc糖基化可能是宮頸癌細胞發生順鉑化療耐藥的重要原因，為改善宮頸癌化療耐藥提供了一個可能靶標。

通常情況下，p53 在E3 泛素連接酶MDM-2 作用下發生泛素化，經蛋白酶體催化降解。有研究顯示，在細胞中過表達OGT 可導致MDM-2 表達和磷酸化水平的升高［18］。此結果表明，p53 的O-GlcNAc 糖基化可能通過促進p53 的泛素蛋白酶體降解，進而促進了宮頸癌細胞的增殖并降低凋亡發生。肺癌細胞中p53 的O-GlcNAc 糖基化可促進p53 蛋白的泛素化和蛋白酶體水解［2］。然而，在乳腺癌細胞中的研究顯示，p53 在Ser 149 位點的O-GlcNAc 糖基化促進了p53 蛋白的穩定［21］。并且，另一研究顯示O-GlcNAc 糖基化可穩定并激活p53 途徑，促進卵巢癌細胞增殖［18］。這種差異可能源于不同位點O-GlcNAc 糖基化的作用不同，因為p53 含有多個O-GlcNAc 糖基化位點［20］。并且上述O-GlcNAc 糖基化對p53 的穩定作用主要通過降低Thr155 的磷酸化而實現，但順鉑的主要作用位點為Ser15［2］。盡管如此，p53 O-GlcNAc 糖基化在宮頸癌發生發展中的作用，特別是其發生位點和機制應被進一步研究探索，為解決宮頸癌化療耐藥性提供更準確的目標［22］。