環狀RNA circ0008016在膠質瘤患者組織中的表達及臨床意義

白義鳳 胡洪林 鄧穎 劉宇

四川省醫學科學院·四川省人民醫院腫瘤中心（成都610071）

膠質瘤是最常見顱內原發性惡性腫瘤，占中樞神經系統腫瘤的47.1%，也是神經系統最棘手的難治性腫瘤之一［1］。目前膠質瘤的治療主要以手術切除結合術后放化療為主，但由于膠質瘤呈彌漫性生長，做不到完全切除，且對放化療敏感性差，因此患者的預后差，中位生存期不足2年，5年生存率僅9.8%，治療后復發率幾近100%，目前臨床上缺乏有效的早期診斷及臨床療效及預后評估指標［2-3］，尋求調控膠質瘤進展的靶向分子、開發更為有效的治療藥物及早期診斷及臨床預后生物標志物是目前膠質瘤臨床治療中亟待解決的難題。

環狀RNA（circRNA）是一種新型的具有獨特性質的非編碼RNA，它不具有5′端帽子和3′端尾巴，是以共價鍵形成的閉合環狀分子［4］。circRNA對RNA 外切酶的降解具有抗性，因此具有比線性RNA 更高的生物穩定性。研究［5］表明，circRNA 在多種疾病的發生、發展中發揮著重要的作用，參與細胞增殖、凋亡、炎癥等病理生理過程。此外，眾多研究證實，circRNA 在腫瘤組織及癌旁正常組織中的表達量差異顯著，且相關circRNA 表達量與腫瘤細胞的惡性程度及侵襲性具有相關性［6］。然而關于circ0008016 在膠質瘤中的作用及機制目前國內外尚未見相關報道，本研究擬進一步研究circ0008016 在膠質瘤組織及細胞中的表達，分析其表達與患者臨床病理特征及預后的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2014年1月1日至2018年12月30日于我院確診的膠質瘤患者組織標本92 例，同時收集33 例腦外傷患者的正常腦組織標本作為對照組。依據2007年WHO 分級對所有樣本進行病理分級（其中Ⅰ級膠質瘤12 例；Ⅱ級29 例；Ⅲ級24 例；Ⅳ級27 例）。80 例患者接受了替莫唑胺（TMZ）化療，其中32 例患者對化療敏感［化療后腫瘤部分或完全緩解（PR 或CR）］，48 例患者化療耐藥［化療后出現進展或疾病穩定（PR 或SD）］。所有患者術前均未經放療、化療以及其他中藥免疫治療。所有組織標本在手術切除后立即保存于2 mL 無菌凍存管并立即投至液氮中速凍。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。所有患者術后均進行了隨訪。隨訪起點為手術或病理活檢日，末次隨訪時間為2019年5月1日，隨訪時間5 ～49個月，中位隨訪時間36個月，至隨訪截止日，存活病例30例，死亡病例59例，3 例失訪。

1.2 細胞培養人膠質瘤細胞株U251、U87 及正常人腦膠質細胞HEB 均來自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養。

1.3 細胞轉染細胞轉至6 孔板中培養，待細胞生長到70%匯合時，按分組LipofectamineTM2000 和OPTI-MEM I（Invitrogen）將si-circ0008016 表達載體和si-NC 空載體轉入細胞，每組均設陰性對照，轉染后24 和48 h，提取細胞總RNA 備用，并用G418篩選單克隆建立穩定轉染細胞株。

1.4 CCK8 法檢測細胞增殖取對數生長期的各組細胞，接種于96 孔板，每孔細胞數2.0 ×103細胞∕孔，每孔體積200 μL，分別于0、12、24、36、48、72 h，每孔加入CCK8 溶液20 μL，37 ℃繼續孵育0.5 ～4 h，用酶聯免疫檢測儀測定450 nm 的各孔吸光度（A），以時間為橫軸，吸光度（A）為縱軸，繪制細胞生長曲線。每次設3 個平行孔，至少重復2 次。

1.5 Real-time PCR 檢測circ0008016 在膠質瘤組織中的表達水平采用TRIzol 方法提取組織標本中總RNA。將提取的總RNA，逆轉錄反應參照AMV 逆轉錄試劑盒說明，在20 μL 體系中加2 μg總RNA 進行cDNA 的合成。Real-time PCR 采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA 作為摸板，引物濃度0.4 μmol∕L，15 μL 體系進行擴增，每個待測樣本設置3 個平行樣，根據目標基因設計合成相應上下游引物進行PCR 擴增。以GAPDH 作為內參照。PCR 反應在定量PCR 反應儀上進行。3 次獨立實驗后得到的數據運用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行定量分析。

1.6 流式細胞儀分析細胞凋亡變化Annexin V∕PI 染色法。對數生長期的細胞以4×105∕孔接種于6 孔板中；將si-circ0008016 和si-NC 轉入細胞，37 ℃培養48 h；收集細胞，PBS 洗滌2 次；細胞重懸 于100 μL 含Annexin V-FITC 和0.5 μg PI 的結合緩沖液（10 mmol∕L HEPES pH 7.4，0.15 mol∕L NaCl，5 mmol∕L KCl，1 mmol∕L MgCl2，1.8 mmol∕L CaCl2）中；避光室溫孵育15 min；加入400 μL 結合緩沖液；流式細胞儀分析，按下列公式計算細胞的凋亡指數：細胞凋亡指數=（早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數）∕總細胞數×100%。

1.7 CCK8 法檢測藥物敏感性實驗以每孔3×103個細胞接種于96 孔培養板中，每孔加入100 μL培養液。待細胞貼壁后，參照替莫唑胺化療藥物的臨床血漿高峰濃度，在各組轉染細胞中分別加入0.001、0.01、0.1、1、10、100、1 000 倍臨床血漿高峰濃度的化療藥物，每種藥物的每一濃度設5 個復孔；陰性對照組：僅加細胞不加藥物，設5 個復孔；空白調零組：僅加細胞培養液，設5 個復孔。培養24 h 后，每孔加新鮮配制的CCK8 溶液10 μL，37 ℃、5%CO2下繼續培養4 h，在酶標儀上選擇450 nm 波長測定各孔吸光度，計算各組細胞在不同濃度下的3 種化療藥物的存活率：細胞存活率=（實驗組吸光度均值-空白對照組吸光度均值）∕（陰性對照組吸光度均值-空白對照組吸光度均值）×100%。實驗重復3 次求平均值，以細胞存活率為縱軸，藥物濃度對數為橫軸作半對數圖，并按作圖法計算出3 種藥物的IC50值。

1.8 統計學方法采用SPSS 13.0 統計軟件進行數據分析，計量數據采用表示。circ0008016在組織及細胞中的差異表達采用t檢驗分析。circ0008016 與各臨床病理參數之間的關系使用Chi-Square 檢驗；采用Kaplan-Meier 法分析circ0008016 的表達與生存時間及預后的關系，應用單因素及Cox 比例風險模型分析影響膠質瘤預后的因素，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Circ0008016 在膠質瘤細胞及組織標本中的表達采用QRT-PCR 檢測circ0008016 在膠質瘤細胞及組織標本中的表達，結果發現，circ0008016在人膠質瘤細胞株U251、U87 中的表達明顯高于正常人腦膠質細胞HEB，差異有統計學意義（P＜0.001，圖1A）。circ0008016 在膠質瘤組織中的表達明顯高于正常腦組織標本，差異有統計學意義（P＜0.01，圖1B）；隨著膠質瘤分級的增加，circ0008016 的表達增加，差異有統計學意義（P＜0.001，圖1C）；此外，circ0008016 在替莫唑胺耐藥患者中的表達較替莫唑胺敏感患者明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.001，圖1D）。

圖1 QRT-PCR 檢測circ0008016 在膠質瘤細胞及組織標本中的表達Fig.1 QRT-PCR was used to detect the expression of circ0008016 in glioma cells and tissues

2.2 膠質瘤組織標本中circ0008016 的表達意義根據circ0008016 的平均表達水平，將膠質瘤患者分為circ0008016 高表達組（circ0008016≥9.530）52 例及低表達組（circ0008016＜9.530）40 例，分析circ0008016 的表達與患者臨床預后的關系，結果發現circ0008016 的表達與腫瘤WHO 分級、化療敏感性及生存狀態明顯相關，差異有統計學意義（均P＜0.05），見表1。

2.3 circ0008016 的表達對膠質瘤患者生存的影響采用Kaplan-Meier 法評估患者的生存時間，結果發現與低高表達circ0008016 的患者比較，高表達circ0008016 的患者的總生存時間及無復發生存時間明顯縮短，差異具有統計學意義（P＜0.001），見圖2A、2B。

表1 Circ0008016 的表達與膠質瘤患者中病理特征的關系Tab.1 The relationship of circ0008016 and the pathological features in glioma 例

2.4 circ0008016 對膠質瘤細胞增殖及化療敏感性的影響進一步分析circ0008016 對膠質瘤細胞增殖及化療敏感性的影響，結果發現與轉染si-NC組比較，轉染si-circ0008016 后能明顯降低細胞中circ0008016 的表達，差異有統計學意義（P＜0.001，圖3A），下調circ0008016的表達后能抑制細胞的增殖（圖3B），促進細胞對化療藥物的敏感性（圖3C）。

2.5 單因素及多因素分析影響膠質瘤患者預后的因素單因素分析發現circ0008016 的表達、WHO臨床分級、對替莫唑胺的敏感性是影響膠質瘤預后的因素。多因素分析發現circ0008016 的表達、WHO 臨床分級是影響膠質瘤患者預后的獨立因素。見表2。

3 討論

膠質瘤是中樞系統最常見的原發性腫瘤，國內報道約占顱內腫瘤的35% ～60%。其中，惡性膠質瘤的發病率為（5 ～8）∕100 萬，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌，位列第3 位［7-8］。腦膠質瘤可發生于任何年齡，成人患者平均發病年齡為40 歲，在10 歲左右兒童中亦有一個發病小高峰［9］。2008年世衛生組織數據顯示，腦膠質瘤是34 歲以下腫瘤患者的第2 順位死亡原因。由于腦膠質瘤侵襲性強、治療棘手，其病因和發病機制尚不清楚，目前尚無有效的治療手段［10-11］。因此，闡明其發病機制以尋找有效的治療手段一直是一個亟待解決的難題。

圖2 circ0008016 的表達與膠質瘤患者無復發生存時間（A）及總生存時間（B）的關系Fig.2 The relationship between circ0008016 expression and the recurence free survival time（RFS）and overall survival time（OS）in glioma patients

圖3 circ0008016 對膠質瘤細胞增殖及化療敏感性的影響Fig.3 Effects of circ0008016 on proliferation and chemosensitivity of glioma cells

表2 影響膠質瘤患者預后的因素Tab.2 Prognostic factors of glioma patients

circRNA 是一類新的具有多種調控功能的非編碼RNA，自1991年起，環狀RNA 就開始有報道，但一直沒有深入的研究［12］。2012年，SALZMANN等原先打算檢測兒童急性淋巴細胞白血病細胞中的基因外顯子錯排，卻意外發現了環狀RNA（circular RNA，circRNA）在腫瘤和非腫瘤細胞中廣泛存在。環狀RNA 是在轉錄后，由前體mRNA 的反向剪接（backsplicing）形成，前體mRNA 的下游的剪接供體（downstream splice donor）的3′端與上游的剪接受體（upstream splice acceptor）的5′端共價結合形成的環狀RNA 分子。由于是閉環狀結構，缺乏RNA 酶的作用位點，環狀RNA 結構穩定［13-14］。并且circRNA 含miRNA 結合位點，通過堿基互補配對原則海綿樣吸附相關miRNA，從而調控下游基因的表達［15］，在調控腫瘤進展和轉移中起著重要作用［16-17］。近年研究發現，環狀RNA在腫瘤細胞與正常組織有不同的表達模式與表達水平，與腫瘤的發生、發展有密切的關系，環狀RNA 有可能成為多種腫瘤的治療靶點［18］。研究［19］發現circ_0001730 通過miR-326∕Wnt7B 環促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲。EIF4A3 誘導環狀RNA MMP9（circ MMP9）作為海綿吸附mir-124，促進多形性膠質母細胞瘤的發生［20］。circPCMTD1 通過海綿吸附miR-224-5p 促進膠質瘤的進展［21］。課題組前期通過circRNA 芯片發現circ0008016 在膠質母細胞瘤（GBM）組織中高表達，circ0008016 轉錄自第8 號染色體上的FGFR1 基因（chr8：38287199-38287466，NM_001174064），生物信息結合信號通路串分析發現circ0008016 與EGF 之間存在潛在作用關系。進一步分析發現circ0008016在膠質瘤組織及細胞中的高表達；circ0008016 在高級別的膠質瘤患者明顯高表達，與膠質瘤級別呈正相關；circ0008016 的表達與患者的腫瘤WHO分級、化療敏感性及生存狀態明顯相關。YANG等［22］研究發現Circ-FBXW7 的表達與膠質瘤患者的總生存時間正相關。本研究發現高表達circ0008016 的患者的總生存時間及無復發生存時間較低表達者明顯縮短。QIU 等［23］研究發現circ_0079593 通過海綿吸附miR-182 與miR-433 促進膠質瘤細胞的生長和侵襲，與患者的預后差相關。我們的研究發現下調circ0008016 的表達可抑制細胞的增殖，增加細胞對化療藥物的敏感性。單因素及COX 多因素回歸模型分析提示，circ0008016的表達、WHO 分級是膠質瘤患者獨立的預后因素。本研究首次發現circ0008016 在膠質瘤患者組織標本中高表達，與患者的預后相關，可作為潛在的膠質瘤早期診斷和預后評估的分子標志物。然而影響膠質瘤預后的因素復雜多樣，其具體機制尚需進一步擴大樣本量及分子生物學實驗深入研究。