胃癌組織C19orf28蛋白表達的預后價值

高其忠， 高 翔， 劉 芬， 葛曉松*

1. 江南大學附屬醫院胃腸外科，無錫 214062 2. 江南大學附屬醫院腫瘤內科，無錫 214062 3. 江南大學附屬醫院腫瘤研究所，無錫 214062

胃癌(gastric cancer，GC)是消化系統高發腫瘤之一，其發病率和死亡率已分別躍居癌癥相關第4位和第2位[1]。我國每年新增近68萬GC患者[2-3]，約占全世界GC新發病例的一半；同時，我國每年大約49.8萬人死于GC。GC患者5年存活率非常低[4-6]，超過80%的病例在診斷時已是晚期[7-8]。盡管我國GC患者年齡標準化的死亡率近年來降低[9]，但是其仍然嚴重威害患者的生活質量，給家庭和社會帶來沉重負擔。因此，亟需闡明GC的發病機制，尋找可以診斷GC惡性腫瘤的標志分子和預測患者存活的預后預測因子。

C19orf28也稱PP3501、MFSD12，是新近發現的一種腫瘤相關基因[10]。目前，關于C19orf28蛋白表達與GC預后和生存的相關性鮮見報道。本文擬通過免疫組化(IHC)方法，探討C19orf28是否可以作為GC患者預后的獨立預測因子。

1 資料與方法

1.1 標本來源 納入2013-12-31至2014-12-30在江南大學附屬醫院(無錫市第四人民院)進行根治性手術的141例GC石蠟樣本及其癌旁組織樣本(距癌組織5 cm)。141例患者中，男性112例，女性29例；年齡34～84歲，平均年齡65歲；高/中分化腺癌32例，中低/低分化腺癌109例；TNM Ⅰ～Ⅱ期25例、Ⅲ～Ⅳ期116例，N049例、N1～392例。患者納入標準：(1)原發灶標本為GC，所有標本術后均經2名病理醫師復核證實；(2)術前未接受放、化療；(3)有完整的臨床、病理和隨訪資料；(4)死亡原因僅為腫瘤復發或轉移。本研究經江南大學附屬醫院(無錫市第四人民院)醫學倫理委員會同意；患者知情同意并填寫知情同意書。

1.2 實驗材料 C19orf28多克隆抗體(Cat：bs-9680R，北京博奧森生物技術有限公司)，組織芯片空白蠟塊(UNITMA Quick-Ray UB06-1, 韓國)，GTVesionTM Ⅲ 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒[GK500705，基因科技(上海)股份有限公司]。

1.3 免疫組化檢測結腸癌組織中C19orf28蛋白表達 采用細針打孔方法，分別選取141例胃癌組織及癌旁組織蠟塊中的1 mm圓柱形癌組織或者癌旁組織，制備組織芯片蠟塊。切片并轉移到免疫組化專用載玻片上制成組織芯片。IHC染色步驟如下：常規脫蠟水化；0.01 mol/L檸檬酸納緩沖液(pH 6.0)進行熱修復10 min；3%雙氧水室溫孵育15 min，以阻斷內源性過氧化物酶的活性；滴加C19orf28多克隆抗體(1∶600)，4℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加A液，室溫孵育30 min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的DAB工作液，室溫孵育5～10 min；蘇木精復染；無水乙醇脫水封片。以PBS液替代一抗或二抗作為陰性對照。

1.4 染色結果判斷 C19orf28陽性定位于細胞質，其表達按染色強度評為：無(0分)、弱(1分)、中(2分)和強(3分)；按陽性細胞比例評為：<1%(1分)、1%～10%(1分)、10%～33%(3分)、33%～67%(4分)，>67%(5分)。總體評分值=染色強度+陽性細胞比例評分，評分：≤2分為低表達；>2分為高表達。結果由病理科2位醫師獨立雙盲讀片評定。

1.5 隨 訪 對全部患者進行術后定期隨訪，記錄其完整的臨床相關資料，隨訪截止日期為2018年10月31日。

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0進行分析，計數資料采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier方法分析，影響生存的多因素分析采用Cox回歸方法。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 C19orf28在GC組織中的表達 IHC結果(圖1)顯示：所測GC組織均C19orf28蛋白陽性(陽性率為100%)，癌旁組織均未檢測到C19orf28蛋白；GC組織C19orf28陽性評分為(1.972±0.675)分，與癌旁組織差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 C19orf28在胃癌組織中的表達

A：GC組織C19orf28 染色強；B: GC組織及癌旁組織IHC評分比較. Original magnification: ×400；**P<0.01

2.2 GC組織C19orf28表達與患者臨床病理特征的關系 結果(表1)發現：C19orf28低表達患者(N=98)與C19orf28高表達患者(N=43)性別、神經和(或)脈管侵犯、TNM分期、人類表皮生長因子受體2(HER2)表達、腫瘤分化程度、腫瘤細胞增殖狀態(Ki67)等差異均無統計學意義。

表1 C19orf28表達與患者臨床病理特征的相關性

HER2:人類表皮生長因子受體2

2.3 不同C19orf28表達患者的生存分析 結果(圖2)顯示：C19orf28高表達患者OS短于C19orf28低表達患者，差異有統計學意義(P=0.000 3)。C19orf28蛋白高表達患者平均生存期(23.40個月)短于C19orf28低表達患者平均生存期(38.35個月)，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖2 C19orf28高表達患者與低表達患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 Cox風險回歸模型分析GC患者的生存危險因素 Cox風險回歸模型分析結果(表2)顯示：C19orf28表達、局部浸潤、淋巴結轉移、M分期、神經和(或)脈管侵犯與GC患者預后相關(P<0.05)；C19orf28表達(HR=2.34, 95% CI 1.30～4.21,P=0.005)是GC患者預后的獨立預測因子。

表2 Cox風險回歸模型生存分析

3 討 論

C19orf28是一種多次跨膜蛋白，屬于主要的促進子超家族(the major facilitator superfamily，MFS)。MFS超家族是生物圈中發現的最大的二級載體超家族[11]，對營養吸收和腎臟清除過程中化合物穿過生物膜起重要作用。編碼C19orf28蛋白的基因位于19號染色體；由于可變剪接事件，C19orf28蛋白有兩種蛋白亞型。19號染色體全長大約6 300萬個堿基，包括1 400多個基因，約占人類基因組DNA的2%。19號染色體具有人染色體的最大基因密度，是多種免疫球蛋白超家族成員的遺傳家園，包括殺傷細胞和白細胞Ig樣受體、細胞間黏附分子(ICAMs)、癌胚抗原相關的細胞黏附分子(CEACAM)和妊娠特異性糖蛋白家族(PSG)以及Fc受體等。眼睛顏色和頭發顏色、膚色的關鍵基因也位于19號染色體。C19orf28與歐亞大陸人色素沉著、非洲人色素沉著相關[12-13]，以及與馬的蘑菇毛色[14]、小鼠的灰色毛色[12]和狗的白色毛色[15]有關。

近來研究發現C19orf28具有癌基因功能。Wei等[10]發現，黑素瘤中異常表達的C19orf28通過激活PI3K信號通路促進細胞周期進程，促進細胞增殖、侵襲和轉移；高表達C19orf28是黑素瘤患者OS和DFS的獨立預后因素。Wang等[16]也證明，丁酸鈉處理神經母細胞瘤細胞后顯著誘導pp3501 (C19orf28)上調，而pp3501 (C19orf28)抑制神經母細胞瘤細胞增殖，使細胞周期停滯于G1期。然而，C19orf28是否在胃癌中扮演重要角色目前還不確定。

本研究首次通過IHC方法證明C19orf28與GC患者預后顯著相關。C19orf28蛋白在GC癌組織中高表達(陽性率為100%)。盡管C19orf28蛋白高表達患者與C19orf28低表達患者的臨床病理特征不存在有意義的統計學差異，但是，C19orf28高表達患者OS顯著短于C19orf28低表達患者OS(P=0.000 3)；C19orf28高表達患者平均生存期(23.40個月)顯著短于C19orf28低表達患者平均生存期(38.35個月，P<0.01)。Cox風險回歸模型顯示，C19orf28表達是GC患者預后的獨立預測因子。因此，C19orf28蛋白表達在預測GC患者預后中有一定的應用價值。

綜上所述，本研究通過IHC方法檢測GC組織及癌旁組織中C19orf28蛋白的表達，并結合患者臨床病理特征及隨訪患者預后情況，證實了高表達C19orf28可能是GC患者不良預后的獨立預測因子。