固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定飲用水中雙酚A 和雙酚S

楊金泉，賀小敏,*，施敏芳，陳 浩，李永蓉，朱友林

（1.湖北省環境監測中心站，湖北 武漢 430072；2.華中農業大學理學院，湖北 武漢 430070；3.長江大學資源與環境學院，湖北 武漢 430100）

雙酚A（bisphenol A，BPA）是世界上使用最廣泛的工業化合物之一，主要用于生產聚碳酸酯、環氧樹脂、聚砜樹脂等多種高分子材料，在食品包裝和容器內壁涂裝等方面應用廣泛，在食品的加工、運輸、貯藏等過程中很容易遷移至食品中[1]。近年研究表明，BPA是一種外源性環境激素，具有擬雌激素活性，微量甚至痕量濃度的量也可能對動物生理狀況、生殖系統以及胎兒發育造成不良影響[2]，含有BPA的塑料嬰兒奶瓶在美國、加拿大、日本等國家已禁止使用和銷售[3]。目前，人們常用雙酚S（bisphenol S，BPS）作為BPA的替代品[4]，它是BPA分子中的丙烷基被砜基取代而得到的衍生物（圖1），但有研究表明BPS具有與BPA類似的生物毒性，同樣能對生物體產生雌性激素影響，也是一種內分泌干擾素[5]。GB 5749—2006《生活飲用水衛生標準》[6]規定飲用水BPA不得大于0.01 mg/L；GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標準》[7]規定涂層中BPS的限定值，要求其特定遷移量不得超過0.05 mg/kg。但目前我國還沒有飲用水中BPA、BPS標準檢測方法，因此，建立靈敏高效的BPA和BPS分析方法具有重要意義。

圖1 BPA（A）和BPS（B）的結構式Fig. 1 Structures of BPA (A) and BPS (B)

由于飲用水中BPA和BPS含量通常較低，需要采用液液萃取[8-9]、固相萃取[10-12]和固相微萃取[13-14]等前處理方法進行富集，然后通過氣相色譜[15]、液相色譜[16-17]、氣相色譜-質譜聯用[18-20]或液相色譜-質譜聯用[21-24]等儀器進行測定。液相色譜定性不夠準確、易產生假陽性，且靈敏度較低；氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用測定BPA和BPS往往需要對樣品進行衍生化，操作繁瑣、費時費力；液相色譜-質譜聯用法定性準確、靈敏度高、無需繁瑣的衍生化，在雙酚類環境激素的分析中應用越來越多。目前，利用液相色譜-質譜聯用法測定BPA的研究較多，但對BPS的檢測報道較少。本實驗建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測飲用水中BPA和BPS的定量分析方法，并對湖北省內6 處飲用水源地水樣展開應用分析，為飲用水中BPA和BPS的科學管控提供可靠的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BPA、BPS（純度＞98%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Tedia公司；氟化銨（色譜純） 美國Fluka公司；Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL） 美國Waters公司；0.22 μm微孔濾膜；水為Milli-Q超純水；高純氮氣99.999%。

1.2 儀器與設備

1290超高效液相色譜儀、6460三重四極桿質譜儀（配置電噴霧電離源、ZORBAX Extend-C18反相色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）） 美國Agilent公司；VisiprepTMDL 12孔固相萃取裝置（配有真空泵和虹吸管） 美國Supelco公司；TurboVap LV氮吹儀美國Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備溶液的配制（100 mg/L）：分別準確稱取0.010 0 g BPA和BPS標準品，用甲醇定容至100 mL，4 ℃避光保存。

工作曲線的配制：準確移取BPA和BPS標準儲備溶液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成混合標準中間液，再以甲醇-水溶液（1∶1，V∶V）逐級稀釋為不同質量濃度梯度（1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L）的混合標準工作溶液，4 ℃避光保存。

1.3.2 樣品采集和保存

在湖北省武漢（3 個水廠）、黃石（1 個水廠）、孝感（1 個水廠）、咸寧（1 個水庫）地市6 個飲用水源地共設置12 個監測點位，采集入水口和出水口樣品。樣品采集和保存參考標準GB/T 5750.2—2006《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集和保存》，使用預先洗凈烘干的棕色玻璃瓶保存樣品，避光于4 ℃冷藏，在7 d內萃取，萃取后的樣品應避光于4 ℃冷藏，40 d內分析完畢。

1.3.3 樣品前處理

依次用10 mL甲醇和10 mL超純水對HLB固相萃取柱進行活化，備用。量取500 mL水樣以3～5 mL/min的流速通過活化后的HLB小柱，然后用10 mL 10%甲醇溶液淋洗固相萃取小柱后繼續抽吸1 h。用10 mL純甲醇以1 mL/min的流速洗脫，洗脫液于37 ℃恒溫水浴并用氮氣濃縮至0.5 mL，然后以超純水定容至1 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾后進行超高效液相色譜-串聯質譜分析。

在分析樣品的同時做全程序空白實驗，即按照上述實驗過程以超純水代替水樣完成全部分析流程，檢查分析過程中是否存在污染。

1.3.4 儀器工作條件

1.3.4.1 色譜條件

流動相為1 mmol/L氟化銨溶液（A）和乙腈（B）；流速0.3 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。流動相梯度洗脫程序見表1，后運行3 min。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of ultra performance liquid chromatography

1.3.4.2 質譜條件

電噴霧電離負離子模式，監測模式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，離子源溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min，鞘氣流速11 L/min，霧化器壓力45 psi，毛細管電壓3 500 V。質譜MRM模式參數見表2。

表2 BPA和BPS的質譜采集參數Table 2 Mass spectrometric parameters for BPA and BPS

1.3.5 方法學驗證

用甲醇-水溶液（1∶1，V/V）配制混合標準溶液系列，以化合物質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標作標準曲線。方法檢出限依據標準HJ 168—2010《環境監測分析方法標準制修訂技術導則》，按照樣品分析的全部步驟，對低質量濃度加標樣品進行不少于7 次平行測定，計算標準偏差和方法檢出限。

分別取500 mL空白樣品，添加低、中、高3 個水平的BPA和BPS混合標準溶液，進行添加回收實驗，計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）和加標回收率。

1.4 數據處理

采用Origin 8.0軟件對實驗數據進行處理，計算最大值、最小值、平均值和RSD，并根據化合物的響應值或回收率數據作出相應色譜圖、柱形圖等圖表。

2 結果與分析

2.1 分析條件的優化

2.1.1 質譜參數的優化

分別將1 mg/L BPA和BPS標準溶液注入質譜儀進行質譜參數的優化。先通過全掃描確定化合物的母離子和正負離子采集模式，再進行選擇離子監測優化其碎裂電壓及毛細管電壓使母離子的響應最大，然后對母離子做子離子全掃描，獲得碎片離子信息，選擇豐度較高的2 個特征碎片離子作為定量離子和定性離子，優化碰撞能量使其響應最大，最后得到該化合物的2 個MRM離子對及相應的質譜參數（表2）。在該條件下獲得的BPA和BPS標準溶液的MRM色譜圖如圖2所示。BPA和BPS均在負離子模式采集時響應較高。這主要是由于BPA和BPS均含有酚羥基，易失去一個H＋產生[M-H]-母離子，即負離子模式。

圖2 BPA（A）和BPS（B）標準溶液的多反應監測模式色譜圖Fig. 2 Multi-reaction monitoring chromatograms for BPA (A) and BPS (B) in a standard solution

2.1.2 流動相的優化

圖3 不同流動相下BPA和BPS的響應值比較Fig. 3 Comparison of responses for BPA and BPS in different mobile phases

考察BPA和BPS在酸性、中性、堿性及不同緩沖鹽流動相條件下的分離效果和響應值大小。因甲酸、氨水、醋酸銨、氟化銨等化合物揮發性較強，不易在色譜柱和質譜中殘留，實驗主要采用以上幾種化合物調節流動相pH值和離子強度，對比不同濃度的氨水-乙腈、水-乙腈、甲酸-乙腈、醋酸銨-乙腈、氟化銨-乙腈等作為流動相時，BPA和BPS的響應值大小，如圖3所示。結果表明：這2 種雙酚類物質均在氟化銨-乙腈條件下響應值最高，峰形最好。進一步考察不同濃度（0.5、1 mmol/L和2 mmol/L）氟化銨-乙腈作為流動相對BPA和BPS響應值的影響。結果顯示，隨著氟化銨濃度增大，兩種雙酚類物質響應值均有所增加，2 mmol/L氟化銨與1 mmol/L氟化銨時，其響應情況相當，考慮到氟化銨有一定的腐蝕性，濃度過大可能對色譜柱有一定的損害，故最終確定1 mmol/L氟化銨溶液-乙腈為流動相。

2.2 前處理條件的優化

2.2.1 固相萃取柱的選擇

由于BPA和BPS屬弱極性化合物，通常采用C18柱、HLB柱等反相柱對其進行富集，實驗比較了相同規格的C18、HLB、NH2固相萃取柱對BPA和BPS的回收率情況（圖4）。結果表明，NH2柱對BPA和BPS的富集效果很差，尤其是對BPA基本無保留；C18柱對兩種物質的保留能力一般，回收率低于62%；而HLB柱對各目標物的保留能力相對較好，回收率分別為85%和97%。這可能是由于BPA和BPS極性偏強，但電離程度弱，主要呈分子形態，不適宜采用NH2柱這類離子交換型填料，而C18柱更適合富集非極性化合物，萃取原理為疏水效應。相比較而言，HLB柱中的填料是一種親水親脂型聚合物，可富集的化合物極性范圍較寬，因此HLB柱對BPA和BPS均有較好的萃取效果。

圖4 不同固相萃取柱對BPA和BPS回收率的比較Fig. 4 Comparison of recoveries for BPA and BPS on different SPE columns

2.2.2 淋洗液的選擇

為去除基質干擾，可在洗脫前對固相萃取小柱進行淋洗，通常在淋洗液中添加一定比例的甲醇，去除部分強極性或水溶性雜質，但同時也可能造成目標物的損失[25]。本實驗考察不同體積分數（5%、10%、15%、20%）的甲醇溶液作為淋洗液時，樣品基質去除情況及回收率情況。結果表明，當甲醇體積分數為10%時，BPA和BPS回收率分別為84%和95%，而當甲醇體積分數增至15%時，BPA回收率下降較多，僅為67%。因此要保證回收率的同時，最大程度去除基質干擾，應選擇10%的甲醇溶液為淋洗液。

2.2.3 洗脫液和體積的選擇

根據文獻報道，使用C18和HLB小柱萃取BPA和BPS時，大多采用甲醇和乙腈作為洗脫劑[23,26-29]。因此實驗比較了甲醇和乙腈對兩種目標物的洗脫情況，結果發現兩者洗脫效果相當，考慮到乙腈沸點高（甲醇沸點64.7 ℃、乙腈沸點81.6 ℃），濃縮時間長，因此選擇甲醇為洗脫劑。考察不同體積的甲醇對兩種化合物的洗脫情況，作出流出曲線（圖5）。由圖5可見，BPA和BPS在洗脫體積為10 mL時回收率已趨于穩定，因此方法最終選擇洗脫劑用量為10 mL。

圖5 BPA和BPS的流出曲線Fig. 5 Elution curves of BPA and BPS

2.3 線性關系、精密度、準確度和檢出限

分別以BPA和BPS峰面積為y軸，化合物質量濃度為x軸繪制標準曲線，得到線性回歸方程，結果見表3。BPA和BPS在1～100 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均超過0.995。將兩種雙酚類化合物標準樣品添加至超純水中（BPS 2 ng/L、BPA 10 ng/L），按照上述條件進行前處理，平行測定7 份樣品，按照3.143 倍標準偏差獲得兩種化合物的方法檢出限，與已有報道相比，本方法檢出限低1～2 個數量級，能夠滿足飲用水中痕量BPA和BPS的分析測定要求。

表3 BPA和BPS的標準曲線和方法檢出限Table 3 Linear equations and LODs for BPA and BPS

表4 BPA和BPS的加標回收率和RSD（n= 3）Table 4 Recoveries and RSDs of BPA and BPS (n= 3)

按優化的方法進行目標化合物的加標回收率實驗，在純水中加入低、中、高3 個水平的BPA和BPS標準樣品，每個添加水平設置3 個平行樣，計算加標回收率和RSD（表4）。結果表明，BPS和BPA加標回收率分別為83.7%～98.2%和88.3%～114.8%，RSD為5.9%～12.3%和10.0%～16.2%。此外，實驗還對實際水樣進行了基體加標實驗（表5），兩種化合物的加標回收率分別為80.9%～96.2%和74.8%～118.0%。比較發現本研究純水和實際水樣中BPA和BPS的加標回收率范圍與已有文獻報道相當，表明本方法準確度較好，適合于飲用水的分析測定。

表5 BPA和BPS的實際樣品分析結果Table 5 Contents of BPA and BPS in drinking water samples

2.4 實際樣品的分析

采用建立的固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，對湖北省地市內6 個飲用水源地共12 個點位的水樣中BPA和BPS進行分析，其中5 個點位有不同程度的BPA檢出（表5），質量濃度范圍為2.3～14.8 ng/L，BPS均未檢出，空白樣品和實際樣品色譜圖見圖6。與已有文獻[29-31]分析比較發現，本研究飲用水樣中BPA質量濃度范圍與已有文獻報道基本一致，而飲用水中BPS鮮見有報道檢出。

圖6 BPA空白樣品（A）和實際水樣（B）MRM圖Fig. 6 Multi-reaction monitoring chromatograms for BPA in a blank sample (A) and water sample (B)

3 結 論

本研究采用HLB固相萃取樣品中BPA和BPS，經超高效液相色譜-串聯質譜法定量，建立了飲用水中痕量BPA和BPS的檢測方法。利用該方法對湖北省內6 處飲用水源地樣品進行BPA和BPS含量測定，結果表明，本方法操作簡單高效、定性準確、精密度好、檢出限低，遠低于GB 5749—2006規定的BPA限定值0.01 mg/L，滿足飲用水檢測限量要求。