熒光定量PCR法與直接涂片抗酸染色法檢測結(jié)核桿菌結(jié)果對比

季雪蘭

宿遷市鐘吾醫(yī)院，江蘇 宿遷 223800

肺結(jié)核是一種臨床常見病，近年來，由于空氣污染、吸毒、HIV感染等因素的影響，人體免疫功能明顯降低，肺結(jié)核的發(fā)病率顯著增高，肺結(jié)核已成為目前嚴(yán)重危害我國人類身體健康的重大疾病[1]。目前，臨床診斷肺結(jié)核的方法有實(shí)驗(yàn)室診斷、X線診斷以及臨床癥狀等，直接涂片抗酸染色是臨床常用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，靈敏度以及特異性相對較低，牛群[2]等學(xué)者認(rèn)為，熒光定量PCR法在結(jié)核桿菌診斷中準(zhǔn)確性相對高于直接涂片抗酸染色檢測，臨床應(yīng)用價(jià)值較高。鑒于此，本文為進(jìn)一步研究熒光定量PCR與直接涂片抗酸染色在肺結(jié)核患者痰標(biāo)本診斷中的應(yīng)用價(jià)值，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年4月-2018年12月為研究時(shí)間，醫(yī)院倫理委員會已批準(zhǔn)本次研究，研究對象是本院檢驗(yàn)科收集的150例疑似肺結(jié)核患者痰標(biāo)本。64例女性、86例男性；年齡22-78歲，年齡（50.62±5.49）歲；病程在2-18周，病程均值（10.26±1.14）周；體重45-92kg，體重均值（68.52±5.46）kg。乙組（75例）。排除研究前4周進(jìn)行抗結(jié)核治療者；處于哺乳、妊娠期女性；免疫系統(tǒng)疾病。

1.2 方法 儀器、試劑：PCR熒光定量分析儀（型號：ABI StepOne；生產(chǎn)企業(yè)：上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)器材技術(shù)有限公司），試劑由艾康生物科技（杭州）有限公司提供。抗酸染液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

檢測方法：嚴(yán)格遵守《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》及產(chǎn)品操作說明書（1）熒光定量PCR：a：在待測痰液中加入4倍體積的4%NAOH,混勻，室溫下放置30分鐘至1小時(shí)使其充分液化。b；取液化后的標(biāo)本0.5mL于1.5mL的離心管中加入4%NAOH后放置10分鐘，速率為13000r/min，離心10min。C：去上清，沉淀中加入1mL滅菌生理鹽水，振蕩并搖晃均勻。速率為13000r/min，離心10min。再重復(fù)洗滌一次。d：去上清，沉淀中加入核酸提取液50ul，搖晃均勻，在100℃的溫度下恒溫處理10min，然后12000r/min，離心10min，棄上清置于備用。e：取陰陽對照各20ul，分別加入取2uL核酸提取液，混勻后在100℃的溫度下恒溫處理10min，然后12000r/min，離心10min，棄上清置于備用。f：試劑配制。g：加樣。h：PCR擴(kuò)增及熒光檢測。結(jié)果解釋：檢測樣本CT值無數(shù)據(jù)時(shí)，報(bào)告為陰性，檢測樣本CT≤38.0者為陽性，檢測樣本CT＞38.0為實(shí)驗(yàn)灰區(qū)（2）抗酸染色：挑取痰標(biāo)本中干酪樣、膿樣、或可疑部分0.05mL，與玻片上均勻涂抹成10mm＊20mm的卵圓形痰膜，自然干燥，紫外燈下照射1小時(shí)滅菌，加熱固定，然后進(jìn)行抗酸染色，染色完成后置于顯微鏡下觀察：觀察300個(gè)視野未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌報(bào)告陰性，發(fā)現(xiàn)1-2條及以上報(bào)告為陽性。

1.3 觀察指標(biāo) 對比兩種檢測方法抗酸桿菌陽性檢出率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理選擇SPSS26.0軟件，t檢驗(yàn)計(jì)量資料，以（Mean±SD）形式表述，χ2檢驗(yàn)計(jì)數(shù)資料，以[n/（%）]表述，P＜0.05，即為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對比兩種檢測方法結(jié)核桿菌陽性檢出率 熒光定量PCR結(jié)核桿菌陽性檢出率（90.00）明顯高于直接涂片抗酸染色結(jié)核桿菌陽性檢出率（74.67%），P＜0.05（差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），見表1。

表1 對比兩種檢測方法抗酸桿菌陽性檢出率[n/（%）]

2.2 對比兩種檢測方法結(jié)核桿菌特異性及敏感性 熒光定量PCR檢查特異性（86.67%）、敏感性（97.78%）均明顯高于抗酸染色特異性（60.53%）、敏感性（89.29%），P＜0.05（差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），見表2、表3。

表2 熒光定量PCR檢查結(jié)果

表3 直接涂片抗酸染色檢查結(jié)果

3 討論

結(jié)核病的診斷一直以來均依賴于直接涂片抗酸染色檢查，但直接涂片抗酸染色檢查的陽性檢出率普遍較低，且容易受到標(biāo)本、試劑、人為等因素影響，在結(jié)核病診斷中具有一定的局限性[3]。熒光定量PCR主要檢測“TB-DNA”，充分利用了PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）特異性、敏感性高等特點(diǎn)將DNA以及PCR探針雜交技術(shù)集為一體，可以直接探測PCR過程中的熒光變化情況，以DNA模板獲取準(zhǔn)確的定量結(jié)果，彌補(bǔ)了抗酸染色檢查的不足，極大的提高了結(jié)核桿菌陽性檢出率，具有可定量、靈敏度高、特異性高、操作簡單、污染少、可定量等優(yōu)點(diǎn)。熒光定量PCR法CT值與DNA量對數(shù)呈線性關(guān)系，如果信號增強(qiáng)至熒光閾值，則CT值會被記錄下來，根據(jù)CT值可以將樣本中的TB-DNA含量計(jì)算出，起始拷貝數(shù)量越多，CT值越小。王霖[4]等研究結(jié)果與本研究結(jié)果接近，提示熒光定量PCR檢查法在結(jié)核病診斷中應(yīng)用價(jià)值較高。

綜上所述：結(jié)核病患者采納熒光定量PCR檢測，可顯著提高結(jié)核桿菌陽性檢出率，為患者早期接受針對性治療提供科學(xué)的參考依據(jù)，臨床價(jià)值較高，值得將該檢測方法進(jìn)一步推廣。