結核活動性與T細胞亞群及斑點試驗的臨床分析

劉洪璐，劉梅艷，陸霓虹

（昆明市第三人民醫院 呼吸內科，云南 昆明 650041）

肺結核（pulmonary tuberculosis，TB） 發展歷史悠久，嚴重危害人類的健康和生命，全球分布廣泛。2017年，全球約有1000萬結核新發病例，在10萬人中有133例結核患者。從2011-2016年我國肺結核發病人數及死亡人數、發病率均呈逐年緩慢下降趨勢。我國人口基數大，是結核病高發國家，雖然結核病防治工作日漸成效，但依舊任重道遠。據統計我國2016年結核發病人數仍有83.6萬，發病率約為61/10萬[1]，位居世界第三，因此，結核早期診斷及防治工作尤為重要。

結核免疫以細胞免疫為主，結核桿菌作用于T細胞使其致敏并釋放出多種淋巴因子如干擾素（Interferon，IFN） 和白細胞介素（Interleukin，IL）等[2]，能激活巨噬細胞，促進細胞內溶酶體含量增加、酶活性增高，使活化的巨噬細胞吞噬能力增強[3]，對殺滅原發灶中的結核桿菌起著顯著作用。結核分枝桿菌可誘導強烈的細胞免疫反應，因此，檢測結核分枝桿菌特異的T淋巴細胞可作為檢測感染的一種新路徑。結核特異性T細胞IFN-γ體外釋放試驗 （T cell-based IFN-γ release assays，IGRA）近年來應用廣泛[2]。其原理是通過檢測機體的細胞免疫功能來判斷是否存在結核分枝桿菌感染。人體初次感染結核分枝桿菌后使T淋巴細胞轉化為記憶T淋巴細胞，當人體再次接觸結核分枝桿菌后，會迅速產生效應T淋巴細胞，釋放以γ-干擾素（IFN-γ）為主的一系列細胞因子。在機體外用分枝桿菌特異抗原刺激受試者外周血單個核細胞，測定分離至全血或單個核細胞的INF-γ釋放水平，可以判斷是否有MTB感染。結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）簡稱斑點試驗是常用的一種IGRA。

因此，結核的發生與患者的免疫狀況密切相關，結核斑點試驗亦與機體免疫相關，但它們之間的關系究竟如何，是否能指導臨床早期甄別或定性肺結核，目前尚未有研究報道。本研究擬探索肺結核患者的細胞免疫狀態、斑點試驗與結核活動性之間的相關關系，為早期甄別活動性肺結核患者提供臨床依據和診療策略。

資料與方法一、研究對象 回顧統計分析了昆明市第三人民醫院2018年4月-11月于呼吸與危重癥醫學科住院的臨床診斷肺結核的103例住院患者，其中男性56例，女性47例。患者年齡在13～94歲，中位年齡44歲，青年（＜40歲）44例，中年（40歲～64歲） 36例，老年（≥65歲） 23例。

二、研究方法 患者入院后完善相關檢查，最終臨床診斷為肺結核患者或既往感染者。患者入院后均進行了CT檢查確認肺部病變，完善了斑點實驗，T細胞免疫實驗等檢查。

三、數據分析 運用SPS22.0統計軟件進行數據的統計分析，數據的表示：正態分布數據使用均數±標準差表示，非正態分布數據使用中位數（四分位間距）表示。數據之間兩兩比較：正態分布資料使用t檢驗，非正態分布使用非參數檢驗中的Mann-Whitney檢驗比較兩組數據之間的差異是否具有統計學意義。數據之間的相關性比較：兩計量資料之間的相關性分析使用Pearson相關性檢驗，二分類資料之間、二分類資料與計量資料之間的相關性分析使用Spearman相關性檢驗，以P＜0.05為差異具有統計意義。經比較分析，所有數據中僅患者CD3+、CD4+T細胞數、CD4+T細胞百分比的分布符合正態分布，其他數據均不符合正態分布。

結果一、斑點試驗、活動結合、細胞免疫之間兩兩相關性比較

經兩兩比較分析，T-SPOT試驗抗原A及抗原B 之間顯著相關 （P＜0.001）；CD3+，CD4+，CD8+的T細胞數目之間兩兩均有相關性，P＜0.01。此外，結核的活動性與痰檢陽性率有關（P＜0.05）；結核的活動性與CD3+T細胞數量以及CD4+T細胞百分比有關（P＜0.05）；以上各組具體相關系數見表1。斑點試驗陽性情況（抗原A、抗原B數量均≤3個即認為斑點試驗陰性）、斑點試驗抗原A、抗原B具體數值與細胞免疫缺乏（T細胞亞組任意指標數低于正常參考值范圍）、CD3+，CD4+，CD8+具體數量及百分比均無相關關系；結核活動性與斑點試驗之間也無相關關系。

二、活動性肺結核與陳舊性肺結核之間的比較

因肺結核活動性與CD3+T細胞數目有相關關系，按活動性肺結核、陳舊性肺結核將患者分為2組，其中活動性肺結核有88例，陳舊性肺結核有15例。CD3+T細胞在活動性肺結核患者血液中的平均含量為（1004.2±449.6） 個/μl，在陳舊性肺結核為（1273.5±477.6） 個/μl，在活動性肺結核患者血液中的數量低于陳舊性肺結核患者（P＜0.05）；CD4+T%在活動性肺結核患者血液中的平均比率為36.29%±10.7%，在陳舊性肺結核為43.33%±9.24%，在活動性肺結核患者血液中的數量低于陳舊性肺結核患者（P＜0.05）。其余因素與結核活動性無明顯相關關系，具體參數見表2。

討論肺結核仍是嚴重威脅我國人口健康的呼吸道傳染病之一。早期卡介苗的誕生在一定程度上降低了我國結核的感染率，但隨著耐藥結核的產生和播散，越來越多的難治性結核威脅著人們的生命健康。及時發現、診斷肺結核患者，做好呼吸道隔離對降低肺結核的發病率、耐藥結核感染率以及患者死亡率均有重要的意義。

斑點實驗試驗是近年來運用較多的結核相關檢查之一，在診斷結核感染方面具有較好的靈敏度和特異性[4]。斑點實驗包括檢測抗原A及抗原B，抗原A為分泌抗原6（ESAT-6），抗原B為濾液蛋白10（CFP-10），抗原A和抗原B在檢測過程中分開計數，最后根據陽性斑點數即可推斷樣本中結核致敏的T細胞數量[5]。本研究也表明抗原A和抗原B的表達性是一致的，其呈正相關關系。結核分枝桿菌早期分泌ESAT-6和CFP-10在動物模型中具有較強的T細胞免疫性，是結核疫苗的候選因子[6]。然而，也有大量證據表明這些抗原蛋白在結核分枝桿菌感染過程中是有毒因子[7]。已有研究表明，ESAT-6通過溶解上皮細胞和巨噬細胞[8]和破壞噬菌體脂質體，減少巨噬細胞產生IL-12，從而抑制抗原呈遞細胞功能，使MTB及其產物逃逸噬菌體[9]，并促進MTB的細胞內傳播[8]。也有研究表明，ESAT-6直接抑制人T細胞IFN-G的產生[10]。因此，斑點試驗抗原A及抗原B與人體免疫狀況有關，也應與T細胞亞群有一定的關系。但在本實驗中，通過統計分析，斑點試驗陽性率、抗原A或抗原B數量與T細胞亞群各種數據間均無明顯相關關系，其主要原因考慮與檢驗方法有關。在斑點試驗檢測過程中，收集外周血過濾出其中的免疫細胞，通過濃集使T細胞總數達到一定數量后才進行相關檢測分析。這種方法對提高細胞免疫缺陷患者斑點試驗陽性率有較高的幫助，但對于免疫缺陷患者，原本較少的T細胞通過濃集，達到了和免疫正常患者同樣的數量級，因此免疫缺陷患者和正常患者的斑點試驗并無明顯差異。今后或許可通過收集等量血液，濃縮T細胞后檢測抗原A和抗原B含量，這樣的試驗方式或許可以發現其與T細胞亞群之間的關系。

表1 斑點試驗、活動結合、細胞免疫之間的關系指標

表2 活動性肺結核與陳舊性肺結核之間的抗原和淋巴細胞比較

活動性肺結核與陳舊性肺結核患者PPD試驗與斑點試驗常為陽性，CT顯示病灶有時候也很難區分是否活動。有的活動性結核患者并無典型的結核中毒癥狀，因此臨床區分結核的活動性較為困難，直接影響了結核的治療。而免疫缺陷患者更易感染結核，因此，本研究從細胞免疫方面入手分析T細胞亞群與結核活動性的情況。

T細胞在細胞免疫中發揮著重要的作用，根據T細胞表面的生物標記T細胞可以劃分為不同的亞群。幾乎所有成熟的T細胞表面都有表達CD3+表達[11]。Ti/Th細胞（以CD3+CD4+表達為特征） 是免疫應答中主要的反應細胞，在免疫過程中輔助其他淋巴細胞，包括B細胞的成熟和細胞毒性T細胞和巨噬細胞的激活。Ts/Tc細胞（CD3+CD8+）通過結合主要組織相容性復合物I類相關抗原來識別其目標，并破壞病毒感染細胞和腫瘤細胞[12]。CD4+/CD8+比值可直接反映機體細胞免疫功能狀態，它們之間既相互促進又相制約。因此CD3+T細胞代表了成熟的T細胞數量，CD4+T%即T細胞中輔助T細胞的百分比。本研究發現CD3+T細胞數量及CD4+T%與結核活動性有相關關系；在活動性肺結核患者血液中，CD3+T細胞含量和CD4+T%比率低于陳舊性肺結核。換言之，成熟T細胞數量減少，輔助T細胞比例減少與結核的活動相關。在結核桿菌侵襲人體過程中需要大量的殺傷T細胞，即CD8+T細胞參與，因此輔助T細胞比率相對減少，符合細胞免疫過程。但CD8+T%的百分比與結核活動并無負相關關系，這可能有其他作用機制，或是因樣本量不足導致的。今后可以擴大樣本量進行相關統計研究其有無相關關系。或許從T細胞亞組分析方面能幫助我們更準確快速的判斷患者是否處于結核活動，是否需用藥治療。此外，在本研究中肺結核活動性與痰檢陽性率相關，這符合活動性結合的診斷，進一步證實本研究的可靠性。

綜上所述，患者CD3+T細胞數量及CD4+T%的細胞免疫狀況可能與肺結核的活動性有關，有望作為臨床鑒別結核活動性的參考指標。