膽堿膳食應激小鼠腸道菌群及代謝

(浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014)

腸道是人體最大的消化器官和微生態系統。研究表明：腸道內定居的菌群被認為是與宿主協同工作的一種類似免疫系統的細胞群體，能促進健康，但有時會引發疾病，具有遺傳和環境因素的個體差異性[1]。而在環境因素中，膳食因素在調節腸道菌群組成中起著關鍵作用。前期文獻報道，改變膳食模式會影響腸道菌群的結構[2]。最近，在大量臨床樣本和動脈粥樣硬化易感小鼠模型中研究發現：小腸微生物代謝膳食磷脂酰膽堿、膽堿和左旋肉堿產生TMAO，促進動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)和心血管疾病(Cardiovascular disease, CVD)的進程[3-8]。該發現已經受到國內外研究者的廣泛關注。膽堿是機體細胞膜的重要組成部分，是維持人體肝臟和肌肉正常功能所必需的一種營養素[9-10]。膳食膽堿可以從日常生活中獲得，如紅肉和雞蛋，但也可以化學合成。然而，在生活中，特別在西方膳食模式下，人們會攝入大量高膽堿食物。目前，關于高膳食膽堿與健康小鼠腸道微生態之間的聯系卻鮮有報道。

因此，筆者建立1%的膳食膽堿健康小鼠模型，應用宏基因組測序及相關測定方法，研究高膽堿飲食對腸道菌群及代謝的影響，以期進一步探索膽堿生理功能，為人們合理、健康的飲食提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

20 只SPF(無特定病原體，Specific pathogen free)級健康C57BL/6J小鼠，雌雄各半，體重(20±2) g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，寄養于浙江工業大學實驗動物中心動物房；1%膽堿飼料購自上海福貝世亨實驗動物飼料有限公司，成分見表1；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸均購自Sigma-Aldrich；小鼠脂多糖ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；鋅和鐵標準品購于國家有色金屬和電子材料分析測試中心。

表1 小鼠飼料營養成分Table 1 Nutrient contents of mice fodder

1.2 實驗樣本與處理

20 只C57BL/6J小鼠飼養于晝夜交替環境中，實驗用水和食物均采用高溫消毒滅菌。小鼠適應環境一個星期后，隨機平分成兩組，即正常組(CK)和1%膳食膽堿組(CHO)。CK組小鼠不做處理，攝入普通飼料；CHO組每天飼喂含1%的高膽堿飼料。每周記錄小鼠體重，觀察小鼠成長情況。在實驗前后分別收集新鮮小鼠糞便，-20 ℃保存備用。實驗周期為60 d，處死前禁食12 h，眼球取血，脫頸處死，血液樣品存于-20 ℃下待用。

1.3 DNA提取

收集CK和CHO組實驗前后每只小鼠200 mg糞便，同組混合，共4 個樣本。即對照組(CK組)和膽堿組(CHO組)分別在0 d和60 d收集的小鼠糞便。利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit試劑盒從糞便中提取混合宏基因組DNA。

1.4 高通量測序和生物學分析

首先將提取得到的腸道DNA進行PCR擴增和純化回收，然后利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照質量比1∶1等量混合后測序。

1.4.1 原始序列數據

Illumina MiseqTM得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別分析轉化為原始測序序列，其中包含測序序列的序列信息以及其對應的測序質量信息。

1.4.2 數據預處理

Miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列。首先需要去除引物接頭序列，將成對的序列拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，最后對各樣本數據的質量進行質控過濾，得到各樣本有效數據。

1.4.3 去除嵌合體及非特異性擴增序列

在PCR反應過程中，會由于延伸不完全產生一些嵌合體，同時也會產生一些非特異性擴增序列。為了保證信息分析質量，必須對其進行剔除。使用Usearch去除預處理后序列中非擴增區域序列，而后對序列進行測序錯誤校正，并調用Uchime進行鑒定嵌合體。隨后，再將去除嵌合體的序列與數據庫代表性序列進行Blastn比對，低于閾值的比對結果被認為是靶區域外序列，并剔除掉該部分序列。

1.4.4 腸道菌群組成的生物學分析

眾多序列按其序列間的距離進行聚類，然后根據序列與序列間的相似性當作域值分為操作分類單元(OTU)，一般域值的序列相似性設定為0.97，則被認為可能屬于屬。對處理后序列進行物種分類，采用的軟件為RDP classifier，RDP classifier是基于Bergey’s taxonomy，采用Na?ve Bayesian assignment算法對每條序列在genus水平上計算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分類閾值，則說明此分類結果可信(測序片段長度<250時可適當調低此值到0.5，如只測V3，V6，V4區。Bergey’s taxonomy分為6 層，它們依次為域(domain)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)。本實驗主要在門綱目科屬水平上進行優勢菌群的分析，探索1%膽堿飲食對小鼠腸道菌群組成的影響。

1.5 糞便SCFA測定

取100 mg糞便樣品置于10 mL離心管中，加入1.6 mL去離子水溶解，渦旋振蕩2 min，加入0.4 mL體積分數為50%的硫酸溶液和1.5 mL乙醚，250 r/min的搖床中搖晃45 min，然后3 000 r/min離心5 min。取上清液于干凈的試管中，加入10 mg無水氯化鈣脫水，過0.22 μm濾膜，乙醚定容至1 mL進樣安捷倫氣相色譜。

色譜條件如下：色譜柱為菲羅門ZB-FFAP色譜柱；程序升溫條件為100 ℃保留2 min，8 ℃升到240 ℃保持10 min后230 ℃運行10 min；進樣口溫度250 ℃；FID 350 ℃；以N2為載氣，流速為1.69 mL/min。

1.6 血漿中LPS測定

采用小鼠(Mouse)脂多糖ELISA檢測試劑盒，操作如下：1) 室溫平衡20 min后從鋁箔袋中取出所需板條；2) 設置標準品和樣本孔；3) 標準品孔各加不同濃度的標準品50 μL，樣本孔先加待測樣品20 μL，再加樣本稀釋液30 μL，空白孔不加；4) 標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min(空白孔不加)；5) 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，重復洗板5 次；6) 每孔加入終止液50 μL，15 min內于450 nm波長處測定各孔的OD值。

1.7 糞便微量元素測定

采用原子吸收分光光度法(AAS)測定糞便中微量元素鐵和鋅的質量分數。1) 稱取60 mg干燥后的糞便，加入5 mL 體積分數為65%的硝酸和2 mL高氯酸過夜；2) 隔天樣品在電爐加熱礦化至冒白煙顏色澄清，然后澄清液轉移至容量瓶，去離子水定容到25 mL，過膜備用；3) 空白組制備方法同樣品(不加入糞便)；4) 建立標準曲線：用去離子水稀釋標準品制備0.1，0.5，1，2，5 mg/L的標準品溶液。

1.8 統計學處理

兩組實驗的定量數據結果用均值±標準差(SD)表示。統計分析采用GraphPad Prism 7軟件進行T檢驗分析(GraphPad software, La Jolla, CA)。P值小于0.05被認為有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 膳食膽堿對小鼠體重的影響

如圖1所示，各組小鼠的體重隨著時間的增長而增加，行動活躍，被毛平整光滑，飲食情況無明顯變化并且在整個實驗過程中都保持健康，說明長期攝入1%膽堿飲食對小鼠健康沒有顯著影響。

圖1 小鼠體重隨時間變化圖Fig.1 Body weight of mice changes over time

2.2 膳食膽堿對小鼠腸道菌群組成的影響

腸道菌群由上萬億個典型的不致病的共生微生物組成，在維持機體正常代謝和生理功能中起重要作用[11]。腸道菌群組分和功能的改變在慢病的發生發展中有重要作用，維持腸道菌群組分的平衡穩定是決定宿主健康的重要因素。目前，1%膽堿飲食對健康小鼠腸道微生態的作用研究較少，因此，筆者探索了1%膽堿膳食對小鼠腸道菌群的影響。

2.2.1 膳食膽堿對小鼠腸道菌群門水平組成的影響

由圖2可知：實驗前后各組小鼠門水平上腸道菌群主要的優勢菌為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)，它們的豐度占總菌屬80%以上。低豐度的菌群包括軟壁菌門(Tenericutes)和放線菌門(Actinobacteria)。處理60 d后，CHO組厚壁菌門豐度增加，擬桿菌豐度降低，提高了厚壁菌豐度與擬桿菌豐度的比值，而CK組趨勢則相反。由各組處理前后門水平菌群豐度變化可知，1%膽堿膳食能顯著影響腸道菌群組成。

CK—對照組；CHO—膳食膽堿組；1—實驗處理前；2—實驗處理后。圖2 膳食膽堿對小鼠腸道菌群門水平的影響Fig.2 Effects of choline diet on gut microbiota on phylum level

2.2.2 膳食膽堿對小鼠腸道菌群屬水平組成的影響

由圖3可知：在屬水平上，各組豐度較高的菌主要為毛螺桿菌NK4A136組(LachnospiraceaeNK4A136 group)、幽門螺桿菌屬(Helicobacter)、厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、擬桿菌屬(Bacteroides)、另之菌屬(Alistipes)和葉桿菌屬(Phyllobacterium)。其中，與CK組相比，1%膽堿飲食干預后毛螺桿菌NK4A136組和另之菌屬豐度增加，屬于有益菌，與腸道抗炎相關[12-13]。圖3中顏色深淺代表實際樣本菌群豐度高低。

圖3 膳食膽堿對小鼠腸道菌群屬水平的影響Fig.3 Effects of choline diet on gut microbiota in genus level

2.2.3 膽堿飲食處理對TMAO相關菌的影響

小鼠糞便菌群16s RNA基因組經PCR擴增之后進行宏基因組測序，分析了膳食膽堿處理后TMAO產生相關菌的豐度變化，結果如圖4所示。

圖4 膳食膽堿對TMAO產生菌的影響Fig.4 Effects of choline diet on TMAO producing bacteria

由圖4可知：與CK組相比，高膽堿膳食顯著增加厚壁菌門、梭菌目(Clostridiales)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)豐度，降低擬桿菌門、擬桿菌目(Bacteroidales)的豐度，而對變形桿菌門和顫桿菌克屬(Oscillibacter)豐度影響小。膽堿作為機體日常必需的一種營養素，廣泛存在于雞蛋、紅肉和魚肉中。前期無菌小鼠和人體實驗研究表明，厚壁菌門和變形菌門與TMAO產生相關[14]。而Cho等發現健康志愿者攝入TMAO前體食物后，可造成體內厚壁菌門增加和擬桿菌門缺乏，其與TMAO產生相關[15]。在本研究中，高膽堿飲食可顯著增加厚壁菌門/擬桿菌門豐度的比例，這與以往的報道相一致。同時，梭菌目、瘤胃球菌科、梭菌屬(Clostridirales)、顫桿菌克屬(Oscillibacter)以及鏈球菌屬(Streptococcus)的豐度與血漿TMAO水平具有相關性[16-18]。梭菌目被認為含有代謝膳食膽堿生成TMAO的CutC/D基因[19]。在本研究中，1%膽堿飲食對TMAO相關菌豐度的影響與前期研究報道一致。以上數據表明：高膽堿飲食能提高腸道TMAO產生菌的豐度，具有促CVD產生的風險。

2.3 膳食膽堿消耗提高糞便SCFA質量分數

SCFA是腸道菌群利用宿主不易消化的糖類、蛋白或內源性底物等酵解而產生的重要代謝產物，其組成和總量可以間接反應人體厭氧菌的數量和代謝情況，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸[20-21]。以往研究揭示：SCFA具有多種生理功能，包括供能、促進脂肪和糖代謝、改善腸道微循環、抗炎和免疫調節的作用[22]。在本研究中，1%膽堿飲食對糞便SCFA的影響如圖5所示。與CK相比，CHO組乙酸質量分數顯著增加，而丙酸、丁酸和戊酸的質量分數沒有顯著差異。以上數據表明：對于健康小鼠，高膽堿膳食能促進乙酸的產生。圖5中*代表P<0.05。

圖5 糞便中短鏈脂肪酸質量分數Fig.5 The contents of SCFA in mice feces

2.4 高膽堿飲食對糞便微量元素的影響

鐵和鋅是兩種人體重要的微量營養元素，其在腸道內被吸收，轉運到肝臟、肌肉和血液利用，而后通過糞便、尿液和汗水排出。如圖6所示，相對于CK組，CHO組顯著增加糞便Fe的質量分數，而Zn的質量分數沒有顯著性變化。早期文獻報道：體內低水平的Fe能提高與其他毒性金屬作用的敏感性，保護機體健康[23]。本研究CHO組小鼠糞便中Fe的質量分數增加，說明高膽堿膳食促進體內Fe的排出。圖6中*代表P<0.05。

圖6 膳食膽堿對糞便微量元素的影響Fig.6 Effects of choline dietry on trace nutrition elements in feces

2.5 高膽堿飲食對血漿LPS水平的影響

LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分之一，高水平的細菌LPS會從腸腔進入血液引起體內毒素血癥和全身性的低度炎癥[24]。腸黏膜屏障是腸道健康的生物屏障，能阻止有害物質進入血液，如LPS。由圖7可知：CHO組小鼠血漿LPS濃度顯著降低。最近Zhang等研究報道，補充0.5%的膽堿能明顯改善孕婦血清LPS和炎癥水平[25-28]，筆者研究結果與前期文獻相類似。1%膽堿飲食對腸黏膜屏障具有保護作用。圖7中*代表P<0.05。

圖7 血漿LPS濃度Fig.7 The concentration of plasma LPS

3 結 論

1%高膽堿飲食可影響健康小鼠腸道微生態，其作用表現在正負兩個方面：1) 1%高膽堿飲食能提高腸道抗炎相關菌毛螺桿菌NK4A136組的豐度，增加糞便中SCFA含量，并降低血漿中LPS的水平，起到保護腸黏膜屏障作用；2) 1%高膽堿飲食提高了TMAO相關產生菌厚壁菌門、梭菌目、瘤胃球菌科的豐度，具有增加CVD的風險。因此，如何合理、安全地利用膽堿將是未來重要的研究課題。