發酵食品中抗氧化乳酸菌的篩選與鑒定

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

1956年英國學者Harmna首先提出了自由基衰老學說。自由基衰老理論(FRTA)認為細胞的老化變化是由自由基反應引起的[1]。1990年美國衰老研究權威Sohal教授指出了自由基衰老理論的缺陷[2]，并首次提出了氧化應激的概念。氧化應激即機體自由基生成增加或清除能力降低，引起機體氧化系統和抗氧化系統的功能紊亂，導致自由基在體內積累而引起的一系列氧化損傷過程[3]。多種研究證明：氧化應激不僅與衰老有著密不可分的關系，氧化應激還與腫瘤的發生，哮喘、抑郁癥及各種慢性炎癥等疾病息息相關[4-6]。氧化應激還參與心血管疾病的病理生理過程，引發動脈粥樣硬化、心力衰竭、高血壓和心肌損傷等[7]。

機體自身的抗氧化能力有限，因此，通過攝入外源性的抗氧化劑已成為機體緩解氧化應激的重要途徑。文獻報道具有抗氧化活性的微生物有乳酸菌、酵母菌，及某些致病菌，如炭疽病菌等[8]。其中，乳酸菌是一種被人類廣泛利用的益生菌，常常被應用在食品發酵工業及微生態制劑中。普通酸奶中僅添加保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌，而這兩種菌是“一過性”的保健菌，它們絕大多數不會進入腸道，不能起到調節腸道菌群的作用[9]。因此，現在越來越多的發酵乳中也開始添加除了保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌以外的益生菌。目前，全球公認的益生菌有雙歧桿菌、乳桿菌等。其中短乳桿菌是乳桿菌屬中的重要種群之一，其具有高產酸、去除亞硝酸鹽和產細菌素等功能[10]，尤其是短乳桿菌在發酵食品中去除亞硝酸鹽的作用顯著，具有用量小、作用快和使用方便等特點[11]。此外，Shakibaie等[12]發現一株富硒短乳桿菌，具有作為含硒添加劑的潛力。益生菌類保健品在國外已經發展了許多年，近幾年益生菌制品在國內市場上逐漸得到認可。現已有研究發現有些乳酸菌能夠清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，羥自由基等活性氧自由基，緩解細胞氧化應激[13-14]。乳酸菌作為天然食品添加劑能緩解機體氧化應激以及一些疾病的發生。因此，篩選具有較好緩解氧化應激功能的乳酸菌具有重要研究意義及應用前景。本研究通過體外抗氧化實驗從傳統自制的發酵食品中篩選出具有緩解氧化應激功能的益生菌菌株，以期為開發具有緩解氧化應激功能的乳酸菌食品發酵劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傳統自制的發酵蔬菜：蘿卜、白菜、長豇豆和芥菜；嬰兒糞便，采集于25 d健康嬰兒；MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，檸檬酸二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，磷酸氫二銨2.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫-80 1 mL；二苯基苦基苯肼自由基(Sigma生物試劑有限公司)；DNA抽提試劑盒，由生工生物工程(上海)股份有限公司出品；API50試劑條(生物梅里埃中國有限公司)；鄰菲羅琳、過氧化氫、硫酸亞鐵和抗壞血酸等試劑(均為國產分析純)。

生化培養箱(型號SPX-250B-Z，上海博迅實業有限公司)；紫外/可見分光光度計(型號UV1000，上海天美科學儀器有限公司)；超聲波破碎儀(SONICS，型號VCX500) ；臺式高速冷凍離心機(Thermo，型號Stratos)；聚合酶反應儀(Eppendorf，型號Mastercycler)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集

使用一次性無菌注射器采集發酵蔬菜的湯汁，保存于已滅菌的EP管中。對嬰兒糞便進行無菌采集，采樣后樣品封口膜封口，均保存于4 ℃備用。

1.2.2 乳酸菌的分離純化

將樣品用生理鹽水進行梯度稀釋，將稀釋后的樣品均勻涂布于pH為5.0的MRS固體培養基上，放入37 ℃普通培養箱培養24～48 h。

觀察菌落形態，挑選符合乳酸菌形態的菌落進行3 次劃線純化。對純化后的菌落進行革蘭氏染色和接觸酶實驗。革蘭氏染色陽性，接觸酶實驗為陰性的菌株可初步判定為乳酸菌。

1.2.3 乳酸菌耐受性實驗

1) 乳酸菌的耐酸性測定：將活化后的菌株，以3%的接種量分別接種于pH為2.0，3.0，4.0，6.0的MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h。16 h后測其在600 nm處的吸光值。

2) 乳酸菌的膽鹽耐受能力測定：將活化的菌株，以3%的接種量接種于分別含有0，0.3%，0.5%豬膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h。16 h后測其在600 nm處的吸光值。

3) 乳酸菌的過氧化氫耐受能力測定：將活化的菌株按3%接種于過氧化氫濃度分別為0.4，0.7，1.0 mmol/L的MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h。16 h后測其在600 nm處的吸光值。

1.2.4 乳酸菌體外抗氧化能力測定

1) 樣品的處理

樣品處理參考Lin等[15]的方法。完整細胞懸液：將菌以1%接種于MRS液體培養基，37 ℃培養16 h后4 ℃，4 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌體，收集的菌體經PBS(pH為7.2)洗滌3 次，再懸浮于PBS中，調整菌數至1×109cfu/mL。

胞內提取物：將上述菌數為1×109cfu/mL的完整細胞懸液激進行超聲破碎，功率400 W，工作5 s，停5 s，60 次。破碎后將懸液4 ℃，10 000 r/min離心10 min，收集上清。

2) DPPH清除能力測定

取0.2 mmol/mL的DPPH 1 mL，加1 mL處理過的乳酸菌樣品充分混勻后，室溫避光反應30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清，測定其在波長517 nm處的吸光度Ai，對照組(AO)以等體積PBS代替樣品。以等體積PBS和無水乙醇調0[16-17]，其表達式為

3) 羥自由基清除能力測定

4) 抗脂質過氧化能力測定

在新鮮的雞蛋黃中1︰1加入PBS，磁力攪拌10 min后用PBS稀釋成1︰25的蛋黃懸液。取1 mL蛋黃懸液，0.5 mL樣品，1 mL PBS和1 mL FeSO4(25 mmol/L)溶液混勻，37 ℃保溫1.5 h。然后加入1 mL三氯乙酸(TCA，質量分數為2.5%)，室溫靜置10 min，3 500 r/min，離心10 min。取上清加入2 mL的硫代巴比妥酸(TBA，質量分數為0.8%)，充分混勻后沸水浴10 min；冷卻后于532 nm處測定吸光度A1。A0用等量的樣品溶劑(即PBS)代替樣品[19]，其表達式為

5) 還原活性分析

在0.5 mL的菌懸液中依次加入0.5 mL PBS，0.5 mL鐵氰化鉀(質量分數為1%)，50 ℃水浴20 min，迅速冷卻后加入0.5 mL 10%的三氯乙酸，4 000 r/min離心5 min。取上清1 mL加入1 mL蒸餾水和三氯化鐵(質量分數為0.1%)混合均勻，反應10 min后于700 nm處測定其吸光值，用L-半胱氨酸作為標品[20]。

1.2.5 菌種鑒定

1) 16S rDNA：將乳酸菌ZJ401過夜培養后，取適量菌液利用試劑盒提取全基因組。得到的全基因組用16S通用引物進行PCR(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，將PCR產物送至公司進行測序。將測序結果在NCBI上進行BLAST比對。

2) API50CH菌種鑒定：用API50CH及API50CHL進行乳酸菌的生理生化鑒定，操作步驟按照說明書進行。

3) 生長曲線分析：取50 mL已發酵24 h的菌液離心棄上清，用生理鹽水洗滌后再離心棄上清，置于烘箱中烘干至恒重(65 ℃，24 h)，測其干重，以此為依據分別計算出1, 2, 4, 5, 6, 8, 10 mL發酵液的菌體干重。另取1, 2, 4, 5, 6, 8, 10 mL菌液，離心棄上清后用生理鹽水重懸浮混勻定容至25 mL，分別測其OD600 nm，得到吸光值OD600 nm與菌體干重的生物量標準曲線。另以1%的接種量將乳酸菌ZJ401接種于MRS液體培養基中，每隔2 h取一定量菌液進行OD600 nm測定和pH測定。

1.2.6 統計分析

每個實驗重復3 次，采用SPSS 19.0的單因素方差分析顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的分離純化

從10 種不同來源的樣品中分離得到34 株菌，革蘭氏染色均為陽性，接觸酶實驗均為陰性。因此初步鑒定這34 株菌為乳酸菌，菌落形態為乳白色，表面光滑，邊緣整齊的圓形菌落，鏡檢下可看到這34 株菌為長桿狀或短桿狀。

2.2 乳酸菌耐受性

2.2.1 乳酸菌的耐酸性

乳酸菌需要有較好的耐酸性才能在胃酸環境下維持活性，對34 株菌進行了耐酸性試驗后發現其中有6 株乳酸菌的耐酸性較好，圖1為6株乳酸菌在不同pH條件下的生長情況。圖1中：小寫字母a～f表示同一菌株在不同pH條件下的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。從圖1中可看出：當pH為6，7時，乳酸菌的OD600 nm最高活性最好，說明pH在6.0到7.0左右是這幾株菌的最佳培養條件。6株菌均能在pH為4.0的壞境下生長，其中ZJ906的活性最差。當pH為3.0時，只有ZJ401還具有活性，其余5 株菌均無法生長。當環境pH為2.0時，所有菌株的生長水平與初始一致，所有菌株均無法生長。正常人體的胃液pH最低可達2以下，人體消化不同食物的時間在30 min到4 h不等。因此在pH越低的環境下具有耐受性的乳酸菌越能在胃酸中維持活性，到達腸道。由上可看出ZJ401具有較好的耐酸性。

圖1 乳酸菌在不同pH條件下的生長情況Fig.1 The growth of Lactic acid bacteria at different pH conditions

2.2.2 乳酸菌的膽鹽耐受性

乳酸菌要順利到達腸道，除了需要具有一定的耐酸能力以外，還需要具有一定的膽鹽耐受能力，正常人體腸道中膽鹽質量分數在0.03%～0.3%波動，乳酸菌在此膽鹽濃度下具有活性就有可能在腸道中定植。圖2為6 株乳酸菌在不同膽鹽質量分數下的生長情況，圖2中：小寫字母a～d表示同一菌株在不同膽鹽質量分數條件下的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。從圖2中可以看到：膽鹽對這6 株乳酸菌活性影響均較大，但這幾株乳酸菌在膽鹽質量分數為0.5%的培養條件下都具有活性，說明這幾株乳酸菌對膽鹽有一定耐受能力。

圖2 乳酸菌在不同膽鹽質量分數下的生長情況Fig.2 The growthof Lactic acid bacteria at different concentrations of bile salts

2.2.3 乳酸菌的H2O2耐受能力

H2O2是一種弱氧化劑，會引起人體的氧化損傷。乳酸菌對H2O2的耐受性是篩選緩解氧化應激乳酸菌的重要指標之一。表1為6 株乳酸菌在不同H2O2濃度下的生長情況。從表1可看出：隨著過氧化氫濃度的升高，對除ZJ803以外的菌株生長有一定的影響。但是菌株的存活率均較高，因此這6 株乳酸菌對過濃度為1 mmol/L的過氧化氫都具有耐受性。

表1 乳酸菌在不同過氧化氫濃度下的生長情況

Table 1 Thegrowth of Lactic acid bacteria at different concentrations of hydrogen peroxide

菌株編號OD600 nm0 mmol/L0.4 mmol/L0.7 mmol/L1.0 mmol/LZJ3022.38±0.01a2.07±0.04b1.98±0.02b2.03±0.05bZJ3121.86±0.02a1.76±0.03b1.77±0.03b1.79±0.01bZJ4011.88±0.02a1.72±0.01c1.75±0.02b1.70±0.02dZJ8032.30±0.01a2.31±0.01a2.30±0.02a2.29±0.01aZJ8042.32±0.01b2.39±0.01a2.16±0.01c2.07±0.03dZJ9061.81±0.02a1.75±0.01b1.73±0.02c1.69±0.01d

注：右上標小寫字母a～d表示同一菌株在不同過氧化氫濃度條件下的顯著性分析，字母相同表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。

2.3 乳酸菌體外抗氧化能力

2.3.1 DPPH清除率

DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除實驗常用于抗氧化能力的評價實驗中。當自由基清除劑存在時，DPPH 自由基接受一個電子或氫原子，形成穩定的DPPH-H化合物，使其乙醇溶液從深紫色變為黃色，變色程度與其接受的電子數量(自由基清除活性)成定量關系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析[21]。對6 株乳酸菌進行DPPH清除率實驗，發現其中ZJ302，ZJ804的DPPH清除率均低于5%，其余4 株菌DPPH清除率均在10%之上，如圖3所示。圖3中：小寫字母a～c表示同一種狀態下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。DPPH清除率最高的兩株菌是ZJ401，ZJ803，且發現4 株乳酸菌的無細胞提取物的DPPH清除率均略高于完整菌體，但是實驗發現ZJ803的DPPH清除率實驗的重復性較差。

圖3 DPPH清除率Fig.3 DPPH clearance rate

2.3.2 羥自由基清除能力

芬頓反應是過氧化氫和二價鐵離子催化反應生成具有強氧化能力的羥基自由基，目前芬頓反正也廣泛應用于抗氧化能力的評價實驗中，如圖4所示。圖4中：小寫字母a～d表示同一種狀態下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。從圖4可以看到：4 株菌中ZJ401的羥自由基清除能力最好，其次是ZJ803，ZJ312，羥自由基清除能力最差的是ZJ906。與DPPH清除率實驗相同，4 株菌的無細胞提取物的羥自由基清除能力均高于完整菌體。

圖4 羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate

2.3.3 抗脂質過氧化能力

采用硫代巴比妥酸法進行抗脂質過氧化能力的測定，其原理是不飽和體系的氧化產物與硫代巴比妥酸的反應物在532 nm處有一個強吸收峰，如圖5所示。圖5中：小寫字母a～d表示同一種狀態下不同菌株之間的顯著性分析，字母一樣表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。如圖5所示，抗脂質過氧化能力最好的是ZJ401，其次是ZJ803。而ZJ312的完整菌體與ZJ906的無細胞提取物均沒有檢測到抗脂質過氧化能力。

圖5 抗脂質過氧化能力Fig.5 Anti-lipid peroxidation

2.3.4 乳酸菌還原活性

還原能力與抗氧化活性有一定的相關性，因此還原能力的測定常用于評價抗氧劑活性。如表2所示，ZJ906的還原活性最好，其次是ZJ401，且與DPPH清除率與羥自由清除率一樣，4 株菌的無細胞提取物的還原活性均高于完整菌體的還原活性。

表2 乳酸菌還原活性Table 2 Lactic acid bacteria reduction activity 單位：μmol/L

注：右上標小寫字母a～d表示同一種狀態下不同菌株之間的顯著性分析，字母相同表示沒有顯著性，字母不同表示有顯著性(P<0.05)。

綜合上述4 個抗氧化實驗可以發現：4 株乳酸菌均有一定的抗氧化活性，其中綜合抗氧化活性最好的是ZJ401，其無細胞提取物DPPH清除率可達25.68%，羥自由基清除率為23.72%，還原活性相當于104.67 μmol/L L-半胱氨酸。且從4 個抗氧化實驗結果可以看出：不同的抗氧化實驗結果有一定的相關性。

2.4 菌種鑒定

2.4.1 16S rDNA

ZJ401的16sr DNA的PCR擴增產物如圖6所示，擴增條帶單一，且擴增片段大小在1 500 bp左右。將PCR擴增產物送至公司進行雙向測序，拼接后的序列在NCBI上進行BLAST比對。結果顯示與ZJ401序列同源性最高的菌株為短乳桿菌(相似度99%，序列號NR 116238.1)。

選取同源性高的典型菌種序列，對ZJ401與其發育關系相近的菌株進行遺傳距離計算。應用MAGE 5.0軟件構建系統發育樹，圖7為ZJ401進化樹。

M—標準DNA分子量；1，2，3—ZJ401。圖6 菌株ZJ401的基因組PCR電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of PCR products of ZJ401

圖7 ZJ401進化樹Fig.7 Evolutionary trees of ZJ401

2.4.2 API50CH

對ZJ401進行生理生化鑒定，試劑條結果如表3所示，將試劑條結果通過API Lab進行分析與鑒定。結果顯示菌株ZJ401的鑒定結果為短乳桿菌，其ID值(鑒定百分率)為99.6%，T值(T指數)為1.0。結合16S rDNA序列對比結果和API50CH生理生化結果，鑒定ZJ401為短乳桿菌。

表3 API50CH生理生化鑒定結果Table 3 API50CH physiological and biochemical identification results

表3 (續)

注：+表示反應呈陽性；-表示反應呈陰性。

2.4.3 生長曲線

對抗氧化活性最佳的ZJ401進行生長曲線的測定，結果如圖8所示。6 h時生長進入對數期，18 h以后菌體生長進入平穩期，短乳桿菌ZJ401的對數生長期為6～18 h。發酵液的pH從最初的6.0最后降到4.4。

圖8 ZJ401生長曲線Fig.8 The growth curve of ZJ401

3 結 論

隨著科技進步和生活水平的提高，細胞抗氧化與抗衰老越來越多地為人們所關注。細胞氧化應激損傷與衰老及多種疾病都有著密不可分的關系。本實驗從各種發酵食品中篩選得到34 株乳酸菌，經耐酸耐膽鹽及耐過氧化氫實驗得到6 株耐受性較好的乳酸菌，通過DPPH清除率，羥自由清除率，還原活性，抗脂質過氧化率實驗對菌株的體外抗氧化性進行了鑒定，確定了一株具有優良抗氧化性的短乳桿菌，命名為ZJ401。ZJ401具備優良的體外抗氧化活性和益生性能，為后續乳酸菌的菌種選育，食品發酵工業中功能性抗氧化食品發酵劑的研制，以及新型的益生活菌制劑的開發奠定基礎。