硫酸慶大霉素鹽酸林可霉素注射液細菌內毒素檢查法的建立

王凡 王小婷 李艷華 郭文欣,*

(1 黑龍江省獸藥飼料監察所，哈爾濱 150069；2 大慶市大同區農業農村局，大慶 163515；3 東北農業大學，哈爾濱 150030)

硫酸慶大霉素鹽酸林可霉素注射液是由本實驗室研制的主要治療由鏈球菌、支原體、衣原體等感染引起的豬呼吸道疾病綜合征的獸用復方注射液，主要成分是硫酸慶大霉素和鹽酸林可霉素，兩種藥物分別作用于敏感菌核糖體的不同點位，最終阻礙了細菌細胞合成蛋白質。由于兩種藥物單獨使用不能有效治療由混合細菌感染引起的呼吸道疾病，且耐藥問題限制了兩種藥物在臨床上的單獨使用，經過研究表明，兩種抗菌藥物聯合使用后主要表現為相加或協同作用，同時減少細菌的耐藥性[1-3]。因此，開發硫酸慶大霉素鹽酸林可霉素注射液具有重要的臨床價值。根據2015版《中國獸藥典》制劑通則項下要求，注射用藥需進行細菌內毒素檢查，保證用藥安全。本研究參考2015版《中國獸藥典》附錄1143“細菌內毒素檢查法”項下凝膠法[4]的要求，對本品復方注射液細菌內毒素的限度設定和檢查方法做了相關研究。

1 試驗材料

1.1 儀器

DHG-9070 A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)；XW-80 A旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠)；TAL-40型恒溫試管儀(湛江安度斯生物有限公司)。

1.2 試藥

硫酸慶大霉素鹽酸林可霉素注射液(批號：20160401、20160402及20160403，為河南牧翔動物藥業有限公司生產的中試產品)；細菌內毒素工作標準品(批號：1602010，規格：10EU/支，湛江博康海洋生物有限公司)；鱟試劑1(TAL，批號：1601091，標示靈敏度：0.125EU/mL，湛江博康海洋生物有限公司)；鱟試劑2(TAL，批號：1601105，湛江安度斯生物科技有限公司，標示靈敏度：0.125EU/mL)；細菌內毒素檢查用水(BET，批號：1601270，規格：10mL，湛江安度斯生物有限公司)

2 方法與結果

2.1 樣品細菌內毒素限值(L)的確定

參考2015版中國藥典通則[5]，根據公式L=K/M，式中K=5EU/(kg·h)，M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量。然而，獸藥方面尚未建立完善的細菌內毒素限值確定方法。本研究中參考2015版《中國獸藥典》[4]中硫酸慶大霉素注射液及鹽酸林可霉素注射液細菌內毒素限值要求，其規定慶大霉素中含內毒素的量應小于0.50EU/mg，林可霉素中含內毒素的量應小于0.50EU/mg。因本品為硫酸慶大霉素與鹽酸林可霉素組成的復方注射液，其含量為慶大霉素每毫升150萬單位，林可霉素75mg/mL。因此，為保障本品質量，確保動物用藥安全，將本品的細菌內毒素限度制定為單方硫酸慶大霉素注射液和鹽酸林可霉素注射液細菌內毒素限度所含最低值，即按照本品中含量規格較小的鹽酸林可霉素的限度要求(林可霉素中含內毒素的量應小于0.50EU/mg)，則換算為硫酸慶大霉素鹽酸林可霉素注射液細菌內毒素的限值為注射液中細菌內毒素不超過37.5EU/mL。

2.2 最大稀釋倍數(MVC)確定

根據細菌內毒素最大稀釋倍數計算公式：MVD=cL/λ，其中L為細菌內毒素限值，當L以EU/mL表示時，則c=1.0mL/mL。由此可以得出，最大稀釋倍數(MVD)為300倍。

2.3 TAL靈敏復核試驗

鱟試劑靈敏度復核按《中國獸藥典》2015年版附錄1143“細菌內毒素檢查法”[4]進行，根據TAL靈敏度的標示值，將細菌內毒素工作標準品用BET水溶解，用封口膜封嚴，在旋渦混合儀上充分混合15min，然后將混勻的細菌內毒素工作標準品溶液稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ 4個濃度，取復溶后的規格為每支0.1mL的TAL原安瓶18管，其中4管加入0.1mL濃度為2λ的細菌內毒素標準溶液，4管加入0.1mL濃度為λ的細菌內毒素標準溶液，4管加入0.1mL濃度為0.5λ的細菌內毒素標準溶液，4管加入0.1mL濃度為0.25λ的細菌內毒素標準溶液；另外2管加人0.1mL BET水作為陰性對照。取不同廠家的2批鱟試劑分別進行試驗，結果見表1。2個廠家鱟試劑靈敏度均在0.5～2.0λ范圍內，靈敏度均符合規定。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab.1 The results oflimulus reagent sensitivity re-check

2.4 供試品干擾預試驗

將3批供試品溶液分別用BET水稀釋至原濃度的1、50、100、200和300倍。同時每一稀釋度下均制備含有2λ濃度細菌內毒素的溶液作為供試品陽性對照系列(PPC)。另外取4支，其中2支加0.2mL的檢查用水，記作NC。另外2支分別加0.1mL的檢查用水和0.1mL濃度為2λ內毒素標準溶液，記作PC。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。結果見表2，由結果可知，本品注射液最小不干擾稀釋倍數為100倍。

2.5 供試品干擾試驗

按TAL靈敏度復核試驗項下，細菌內毒素標準溶液的配制方法，BET水制成濃度分別為2、1.0、0.5和0.25λ 4種標準溶液。將3批硫酸慶大霉素鹽酸林可霉素注射液稀釋100倍，用100倍稀釋液將細菌內毒素標準品制成濃度為2.0、1.0、0.5和0.25λ 4種供試溶液。同時做陰性對照(NC)及供試品陰性對照(NPC)，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。按公式Es=lg-1(∑Xs/4)和Et=lg-1(∑Xt/4)，計算各系列反應終點內毒素濃度的絕對值。結果見表3。由表3可見，Es均在0.5～2.0λ范圍內，且Et在0.5～2.0Es范圍內，表明本注射液在100倍稀釋下不干擾細菌內毒素檢查。

2.6 供試品中細菌內毒素檢查

根據上述干擾試驗結果，將3批樣品均稀釋100倍，用此稀釋溶液配制濃度為2λ的溶液，作為供試品陽性對照(PPC)。同時做陽性對照(PC)及陰性對照(NC)。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作，對3批中試供試品進行細菌內毒素檢查。結果見表4，取兩個廠家鱟試劑對3批中試注射液進行細菌內毒素檢查，其結果全部小于預設限值，符合規定。

表2 干擾試驗預試驗Tab.2 The results of preliminary interference test

表3 供試品干擾試驗結果Tab.3 The results ofinterference test

3 討論

藥品的細菌內毒檢查法是一項快速、簡便、標準化程度高的檢測方法，《中國獸藥典》2015版附錄[4]中利用鱟試劑來檢測或量化細菌內毒素，并認定供試品中細菌內毒素是否符合限度要求。本品注射液中細菌內毒素檢查方法為凝膠法，確定本品注射液細菌內毒素限值為37.5EU/mL，最大稀釋倍數為300倍。對兩個廠家生產的鱟試劑進行靈敏度復核后，進行供試品預干擾試驗和干擾試驗，確定本品最小稀釋倍數為100倍。通過兩個廠家鱟試劑對3批中試注射液進行檢查，結果顯示其細菌內毒素均小于規定限值，本品注射液細菌內毒素符合規定，該方法操作簡單、可靠，結果準確。

表4 供試品內毒素檢驗結果Tab.4 The results of bacterial endotoxin test