恩拉霉素質量標準的建立

韓寧寧 楊秀玉 戴青 趙暉

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

恩拉霉素屬多肽類抗生素，結構見圖1，最初在1966年，日本武田藥品工業株式會社研究人員，從日本兵庫縣西宮市的土壤中分離出來的一株殺真菌鏈霉菌Streptomyces fungicidiousNo.B-5477產生的發酵代謝產物[1]。其具有優良的促生長[2]和改善飼料利用率的作用，且具有高穩定性、低毒性、低藥物殘留、不易耐藥等特點，其作為飼料添加劑具有較大的市場需求。

恩拉霉素預混劑于20世紀90年代由日本武田藥業株式會社對我國進口獸藥注冊，其質量標準收載于《進口獸藥質量標準》(1999年版)[3]。2000年，Schering Plough公司收購了日本武田動物保健公司，該產品由Schering plough公司獨家生產經營。2005年，國內生產企業浙江海正藥業股份有限公司與Schering plough動物保健品有限公司合作，生產恩拉霉素預混劑[4]，并于2015年取得國產新獸藥注冊證書，其標準收載于農業部公告2271號[5]。

圖1 恩拉霉素結構Fig.1 The structure of enramycin

雖然目前恩拉霉素預混劑已有法定公告標準，但原料一直沒有相應質量標準進行質量控制。經檢索發現，目前日本藥局方、美國藥典及歐洲藥典中均未收載恩拉霉素原料藥及相關制劑質量標準。經調研發現，各恩拉霉素預混劑的生產企業產品含量均溯源至日本農林水產消費安全技術委員會的標準品。因此，建立恩拉霉素質量標準對于恩拉霉素原料及預混劑的生產及質量控制具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CHB-1型抗生素效價測量儀(北京潮聲技術開發公司)；高效液相色譜儀(HPLC)(Waters e2695色譜系統，Empower 3色譜工作站)；二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler toledo)。

1.2 菌株、樣品、培養基與試劑

枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501(中國食品藥品檢定研究院)。恩拉霉素標準品(來源/批號/含量：日本農林水產消費安全技術委員會/L004993317-000A003/1146u/mg。抗生素檢定Ⅰ號培養基、乳酸緩沖液(pH4.0)、生理鹽水及滅菌水均由北京中海生物科技有限公司配制。乙腈(MERCK公司色譜純試劑)。其余試劑均為分析純。

2 方法

2.1 HPLC-PDA法建立鑒別及恩拉霉素組分檢查方法

2.1.1 方法的建立過程

(1)液相色譜條件的建立：文獻方法[6]為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(65:35,V/V)，檢測波長為267nm。嘗試該方法后發現，空白峰對恩拉霉素峰測定有干擾。通過調節流動相比例，最終確定為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(73:27,V/V)，可排除空白峰對組分測定的干擾。通過掃描PDA光譜圖發現，恩拉霉素組分A與B最大吸收波長均在267nm附近，故仍采用該波長作為檢測波長。

(2)供試品溶液及對照品溶液的選擇：為簡化試驗操作，選擇含量測定項下中間濃度的200u/mL的供試品溶液和標準品溶液。

2.1.2 鑒別及恩拉霉素組分檢查質量標準

(1)鑒別質量標準：在恩拉霉素組分項下記錄的光譜圖中，供試品溶液恩拉霉素A和恩拉霉素B兩主峰的最大和最小吸收波長應與標準品溶液一致。

在恩拉霉素組分項下記錄的色譜圖中，供試品溶液恩拉霉素A和恩拉霉素B兩主峰的保留時間應與標準品溶液一致。

(2)恩拉霉素組分檢查質量標準：色譜條件：采用Alltima C18色譜柱(250mm×4.6mm,5μm)，或同等柱效色譜柱；以0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(73:27,V/V)為流動相；柱溫30℃；檢測波長267nm。精密量取含量測定項下的200u/mL的標準品溶液20μL注入液相色譜儀，采集色譜圖，恩拉霉素組分A與組分B與相鄰雜質峰的分離度應符合規定，組分A的理論塔板數應不小于2000。

測定法：精密量取含量測定項下的200u/mL的供試品溶液20μL注入液相色譜儀，采集色譜圖，恩拉霉素組分A占組分A與組分B的峰面積和的百分比應不小于60.0%。

2.1.3 方法學驗證

(1)專屬性：依據上述方法，采集溶劑空白、供試品溶液、標準品溶液色譜圖，考察溶劑空白是否對組分A或B峰有干擾，組分A或B與相鄰雜峰是否分離良好。

(2)檢測限：將約含200u/mL的標準品溶液用乳酸緩沖液(pH4.0)進一步稀釋，采集色譜圖，至組分A與B信噪比分別約為3，求得方法檢測限濃度。

(3)線性與范圍：取含量測定項下約含1000u/mL的標準品溶液，用乳酸緩沖液(pH4.0)進一步稀釋為100、200、250、300和350u/mL的溶液，分別采集色譜圖。將濃度與組分A與B峰面積和進行線性回歸，考察二者線性關系。

(4)溶液穩定性：將約含200u/mL的恩拉霉素標準品溶液室溫放置0、5、10、15、20和25h，分別采集色譜圖，觀察組分A與B峰面積變化，考察溶液穩定性。

(5)耐用性：采用不同柱溫與流速、不同品牌色譜柱進行測定，考察方法耐用性。

(6)組分限度的制定：收集2個原料藥廠家共10個批次恩拉霉素原料，按照上述方法測定恩拉霉素組分，制定相應組分限度。

2.2 效價法建立恩拉霉素含量測定方法

2.2.1 方法的建立過程

(1)溶劑的選擇：《進口獸藥質量標準》1999年版和2271號公告這2個預混劑質量標準中，約含1000u/mL的溶液溶劑均為丙酮-1mol/L鹽酸溶液-水(35:12:56,V/V/V)(pH3.0)。進一步稀釋所用溶劑分別為pH4.0的醋酸緩沖液和乳酸緩沖液。第一步溶劑擬與上述兩個標準保持一致，并對進一步稀釋所用的緩沖液進行選擇和優化。嘗試了4種不同的緩沖液：pH4.0醋酸鹽緩沖液、pH4.0乳酸鹽緩沖液、pH6.0磷酸鹽緩沖液、pH7.8磷酸鹽緩沖液，考察樣品溶解情況及對枯草芽孢桿菌有無抑菌作用。試驗發現，pH4.0醋酸鹽緩沖液具有較強抑菌作用，不適宜作為稀釋用緩沖液；常用pH6.0及pH7.8的磷酸鹽緩沖液對恩拉霉素溶解性差，會導致樣品析出，亦不適宜。因此最終選用pH4.0的乳酸鹽緩沖液作為稀釋用緩沖液。

(2)培養基的選擇：《進口獸藥質量標準》(1999年版)采用培養基為抗生素I號(pH7.8)；2271號公告采用培養基為非藥典配方培養基，配方為：胨5.0g，牛肉膏5.0g，氯化鈉30.0g，磷酸氫二鈉2.0g，瓊脂13～15g，水1000mL，滅菌后pH值為(8.0±0.1)。采用已篩選固定的溶劑配制10～40u/mL的恩拉霉素溶液，分別加樣于上述兩種培養基中，觀察枯草芽孢桿菌生長情況及抑菌圈直徑。結果發現，菌種CMCC(B)63501在2271號公告培養基上菌層稀薄，使用原液2%的菌懸液濃度，20u/mL的恩拉霉素溶液抑菌圈直徑在20mm左右，超過中國獸藥典[7]規定的15～18mm的范圍。而在抗生素I號培養基上，使用稀釋液0.3%的菌懸液濃度，即可使20u/mL的抗生素溶液抑菌圈直徑在15～18mm范圍內。因此最終采用抗生素I號培養基。

2.2.2 含量測定質量標準

取本品適量，精密稱定，用丙酮-1mol/L鹽酸溶液-水(35:12:56,V/V/V)[用飽和氫氧化鈉溶液調節pH值至(3.0±0.2)]溶解并稀釋制成約含1000u/mL的溶液。用乳酸緩沖液(pH4.0)稀釋制成約含200u/mL的溶液，再用上述緩沖液稀釋制成約含10～40u/mL的溶液。另取恩拉霉素標準品適量，同法配制。照抗生素微生物檢定法(《中國獸藥典》2015年版一部附錄1201)測定。

試驗菌：枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501或CVCC717]。培養基：抗生素I號，乳酸緩沖液(pH4.0)：取乳酸9.01g，加水750mL使溶解，加1mol/L氫氧化鈉溶液50mL，再加水稀釋至1000mL，調節pH值使滅菌后為(4.0±0.1)。

2.2.3 方法學驗證

(1)專屬性：依據上述方法配制空白溶液和標準品溶液，采用稀釋液0.3%的菌懸液濃度測定，觀察空白溶液是否有抑菌作用，標準品中濃度溶液抑菌圈直徑是否在藥典規定的15～18mm范圍內。

(2)線性和范圍：取標準品適量，精密稱定，用丙酮-1mol/L鹽酸溶液-水(35:12:56,V/V/V)[用飽和氫氧化鈉溶液調節pH值至(3.0±0.2)]溶解并稀釋為1000u/mL的溶液。用乳酸緩沖液(pH4.0)將上述溶液稀釋為8.2、10.25、12.8、16、20、25、31.25、39.0625和48.8u/mL的溶液。配制24個菌碟，分為8組，每組3個菌碟。每個菌碟6個鋼管，其中標準品的3個位置滴加25u/mL的中間濃度溶液，供試品的3個位置每組分別滴加剩余8個濃度的溶液。測定抑菌圈直徑。將抗生素濃度的對數值和每組直徑平均值與25u/mL的直徑平均值之差進行線性回歸，考察二者線性關系。

(3)精密度：兩個檢驗員，各平行配制5份100%濃度水平的供試品溶液，采用上述方法進行測定，考察方法精密度。

(4)準確性：將另一批恩拉霉素原料進行含量測定后，取約12.5mg，精密稱定，加入已標定過的12.5mg的原料中，作為回收率測定供試品。平行制備6份上述回收率供試品，照上述方法進行添加回收率測定，考察方法準確性。

3 結果及分析

3.1 鑒別及恩拉霉素組分檢查方法學驗證結果

3.1.1 專屬性

溶劑空白對恩拉霉素組分測定無干擾，組分A與B與相鄰雜峰分離度符合要求，參見圖2～4。

3.1.2 檢測限

圖2 鑒別及組分檢查溶劑空白光譜指數圖Fig.2 Chromatogram of solvent in the enramycin identification and components examiation

圖3 鑒別及組分檢查標準品溶液光譜指數圖Fig.3 Chromatogram of the standard solution in the enramycin identification and components examiation

10u/mL的溶液組分B信噪比為8.6，2u/mL的溶液組分A的信噪比為7.4。故組分A的檢測限為2u/mL，組分B的檢測限為10u/mL。

3.1.3 線性與范圍

濃度與組分A與組分B峰面積之和的線性方程為y=11.504x+1.0875，r=0.9999。結果表明在100～350u/mL范圍內濃度與組分A與組分B峰面積之和具有良好的線性關系。

3.1.4 溶液穩定性

如表1所示，該溶液室溫放置25h穩定性良好。

3.1.5 耐用性

表2所示，不同柱溫與流速耐用性良好。更換色譜柱品牌后，組分A與相鄰雜質峰的分離度均不符合要求，表明該方法對色譜柱柱效有較高要求。另外，在色譜條件選擇時即發現，流動相比例為0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈(65:35,V/V)或(70:30,V/V)時組分A或組分B與相鄰雜質峰的分離度均欠佳；比例為(73:27,V/V)時組分A或組分B與相鄰雜質峰的分離度均符合要求；比例為(75:25,V/V)時組分A 47min洗脫，組分B 60min內不洗脫，分析時間過長。故應控制流動相比例為(73:27,V/V)。在耐用性試驗中未對流動相比例進行進一步考察。

表1 鑒別及組分檢查溶液穩定性結果Tab.1 Results of the solution stability in the enramycin identification and components examiation

表2 鑒別及組分檢查耐用性結果Tab.2 Results of durability in the enramycin identification and components examiation

3.1.6 組分限度的制定

采用上述方法測定2個廠家共10批恩拉霉素原料組分，結果如表3所示。根據該表結果，制定恩拉霉素組分限度為：恩拉霉素組分A占組分A與組分B的峰面積和的百分比應不小于60.0%。

3.2 效價含量測定方法學驗證結果

3.2.1 專屬性

表3 不同批次恩拉霉素原料藥組分測定結果Tab.3 Results of components examiation of 10 batches of enramycin

空白溶液無抑菌圈，標準品中濃度溶液抑菌圈直徑在15～18mm范圍內，菌圈邊緣清晰圓整。

3.2.2 線性和范圍

恩拉霉素濃度的對數與抑菌圈直徑和25u/mL抑菌圈直徑之差的線性方程為y=0.181x+1.3987，r=0.9995。表明在濃度10～48u/mL的范圍內恩拉霉素濃度的對數與抑菌圈直徑線性關系良好。

3.2.3 精密度

結果如表4所示，中間精密度結果良好。

3.2.4 準確性

結果如表5。平均回收率96.3%，RSD為2.9%，準確性結果良好。

4 討論

4.1 性狀及殘留溶劑項未收錄至質量標準中的原因

經考察發現，恩拉霉素原料一般有兩種形式：單體形式和鹽酸鹽形式。單體形式為灰褐色至褐色粉末，鹽酸鹽形式為白色粉末。兩種形式的原料溶解性亦有較大差異。由于無法限定恩拉霉素原料是否必須成鹽，故未將性狀項收錄進質量標準中。

表4 含量測定精密度結果Tab.4 Results of precision in the content determination

表5 含量測定回收率測定結果(%)Tab.5 Results of recovery rate in the content determination(%)

經考察發現，收集到的兩家企業的恩拉霉素原料制備過程中用到的主要有機溶劑為丙酮，亦建立了丙酮的氣相測定方法。但考慮到不同廠家原料生產過程中所用溶劑可能存在較大差異，故未將殘留溶劑項收錄進質量標準中。

4.2 除上述質量控制項目外，質量標準中收錄的其他檢查項目

除上述質量控制項目外，質量標準中亦收錄了干燥失重檢查項。兩個預混劑質量標準中對水分的控制均采用干燥失重的方法，其中《進口獸藥質量標準》(1999年版)采用60℃減壓干燥至恒重，減失重量不得過6.0%；2271號公告采用105℃干燥至恒重，減失重量不得過10.0%。考慮到恩拉霉素結構中不包含結晶水，不存在干燥失重無法除去結晶水的問題，且其在丙酮、甲醇等常見水分測定溶劑中溶解度均較差，故不考慮費休氏法測定水分，僅對60℃減壓及105℃兩種干燥失重條件進行比較。結果表明，同一批原料60℃減壓及105℃ 3h后，二者均可達到恒重，前者失重5.36%，后者失重5.82%。推測由于105℃條件更為劇烈從而更易除去高沸點溶劑。采用105℃干燥至恒重法對收集到的10批恩拉霉素原料進行測定，干燥失重均小于6.0%。因此在質量標準中規定：取本品，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過6.0%。