代謝手術動物模型制備與應用現狀

杜 磊，曲 伸

(同濟大學附屬第十人民醫院，1.減重糖尿病代謝外科， 2.內分泌代謝中心，上海 200072)

隨著社會經濟發展、人們物質生活水平提高，我國肥胖及糖尿病發病率逐年上升。2015年，我國成人超重及肥胖發病率分別為30.1%、11.9%[1]。肥胖與2型糖尿病、高血壓病、高脂血癥等多種代謝性疾病的發生密切相關。數據監測顯示，2013年我國成人糖尿病患病率達10.4%[2]。肥胖與糖尿病嚴重影響居民健康質量。近年來，以袖狀胃切除術(sleeve gastrectomy，SG)、胃旁路術(Roux-en-Y gastric bypass，RYGB)等術式為主的代謝外科發展迅速，2013年全球開展代謝手術達46.8萬例[3]。國內代謝手術起步較晚，但發展勢頭良好[4]，在減體重降血糖方面效果明顯，成為治療肥胖及2型糖尿病的重要治療手段[5-7]。

代謝手術減重降糖的機制，不僅通過減少能量的攝入和吸收，還涉及其他通路機制。已有證據表明，代謝手術可改變神經系統攝食中樞活動[8]。但其具體機制仍不明確，因此進一步研究代謝手術減重降糖等改變代謝的機制具有很大的科研及臨床價值。作為研究的基礎，多種代謝手術動物模型被創造并用于相關科學研究。本文概括總結常見代謝手術動物模型的制備方法及應用狀況。

1 動物的選擇及代謝相關疾病動物模型的制備

1.1 實驗動物的選取

動物選擇范圍廣泛，能夠誘導模擬人類代謝性疾病生理狀態的動物，包括大鼠、小鼠、豬、貓、犬、猴等。通過施加一定的干預措施，制造代謝紊亂狀態，在此基礎上行袖狀胃切除術、胃旁路術等，監測術后實驗動物生理生化及激素指標的變化?；究赡M人類罹患代謝性疾病、接受手術治療前后病理生理的改變。而綜合實驗操控難易程度、實驗可重復性、動物飼養準備條件、經濟因素等，代謝手術模型常選用大鼠[9-10]、小鼠[11]等小型哺乳動物，又以大鼠應用最為普遍[12]。

1.2 代謝疾病模型的建立

動物實驗研究代謝手術對代謝相關疾病，如糖尿病、高脂血癥等的影響及其作用機制，在行手術干預之前往往需要建立實驗動物代謝紊亂的模型。以大鼠為例，根據其罹患肥胖、糖尿病的情況及相關疾病獲得方式，將實驗動物分為自發型、實驗型及轉基因型三類[13]。自發型代謝疾病大鼠，即通過篩選自然基因缺陷而易患肥胖或糖尿病等疾病大鼠，使之近親繁殖，從而培養特定疾病類型的大鼠，如ZDF(zucker diabetic fatty)大鼠、GK(Goto-Kakizaki)大鼠[14]、ZF(zucker fatty)大鼠等，其特征分別為肥胖伴糖尿病、非肥胖伴糖尿病、肥胖伴胰島素抵抗(非糖尿病)[12]。實驗型代謝疾病大鼠，即對正常大鼠施加特定的干預措施，從而造成某種代謝紊亂的動物模型。如通過胰腺切除、鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導[15]、小劑量鏈脲佐菌素聯合高脂高糖飲食誘導[16]等建立糖尿病動物模型。轉基因型動物模型，及利用基因編輯技術改造大鼠基因，使之罹患糖尿病等相關疾病[17]。受制于技術難度及經濟因素，動物實驗開展不及自發型、實驗型廣泛。

在制備代謝手術模型之前，尚需對所用動物代謝紊亂狀態進行評估。而以糖尿病動物模型為例，建模成功與否尚缺乏統一的評估標準。常見實驗動物的血糖生理水平見表1[18]。

綜合文獻報道，多以出現糖尿病多飲多尿癥狀及血糖達標為主要判斷標準。其中血糖的標準，不同造模方法、不同文獻報道標準存在差異[12, 19-20]。

2 代謝手術動物模型的制備

2.1 動物的基本解剖生理特點

成功手術模型的設計與建立，需要熟悉實驗動物的正常生理結構特點。代謝手術，包括袖狀胃切除術、Roux-en-Y胃旁路術、十二指腸-空腸轉流術等，主要在動物胃腸道器官上施加干預措施。因此開展代謝手術動物實驗，必須熟練掌握實驗動物的胃腸道正常生理結構特點。常見實驗動物腸道長度見表2[18]。

表1 常見實驗動物血糖值

表2 常見實驗動物腸道長度

2.2 常見代謝手術動物模型制備方法[9-11, 21-33]

不同文獻報道代謝手術動物模型制備方法略有差異，但都遵循了以下基本程序方法：

2.2.1 術前準備

根據不同實驗目的，選取適當種類及大小動物。以大鼠為例，參照研究設計，可選擇罹患不同代謝疾病的大鼠，如ZDF、GK大鼠等，也可選擇正常SD(Sprague-Dawley)大鼠。以體重200 g(施加干預前)左右的大鼠多見，此體重大鼠生理儲備能力較強、接受實驗干預存活率較高，且操作方便。施加干預前，往往給予3～7 d的適應性喂養。在手術開始前，予以禁食12～24 h，不禁水。

2.2.2 麻醉及預防感染

麻醉方式多為腹腔注射全身麻醉，常用麻醉藥物有1%戊巴比妥鈉(3.5～4.5 mL/kg)。根據手術進程，必要時術中可追加麻醉藥物。也有學者采用濃度2%～5%異氟烷氣體吸入全身麻醉[11]。針對豬等較大體型哺乳動物，進行動物手術實驗麻醉方法相對復雜，一般需鎮靜、鎮痛、肌肉松弛藥物配合使用，術前雞肉注射途徑麻醉誘導，術中靜脈全身麻醉維持[23]，更趨近于人類手術的麻醉方式。

代謝術式屬于胃腸道手術，Ⅱ類切口，術后腹腔感染是導致實驗動物死亡的常見并發癥，因此動物實驗開展代謝手術需要使用抗生素預防感染。常于術前半小時、術后前3天給予下肢肌肉注射抗菌素，所用抗菌藥物以青霉素類、頭孢菌素類常見，如青霉素(30 000 U/kg)、氟氯西林鈉(100 mg/kg)、頭孢唑啉(100 mg/kg)、頭孢替安(30 mg/kg)、頭孢曲松(60 mg/kg)。

2.2.3 手術操作基本流程

按照動物外科手術操作規范，術前常規備皮、碘伏溶液消毒術區、鋪無菌洞巾。受器械設備、操控技術可行性等條件限制，目前動物實驗開展代謝手術，當實驗對象為大鼠、小鼠、兔等體型較小哺乳動物時常行開腹手術；而當實驗對象為豬等體型較大動物時則可行腹腔鏡手術。

以大鼠為例，開腹手術以上腹部正中切口最為常見，長約2～4 cm，逐層進腹。以豬為實驗對象行腹腔鏡手術時，根據手術操作難易程度取4～5個5 mm的Trocar孔：首先選取生殖器頭側2 cm位置建立觀察孔；建立氣腹，壓力維持在10 mmHg左右；根據體型大小及腹部輪廓合理選擇各操作孔位置。下文以實驗動物鼠為例，介紹臨床開展最多的袖狀胃切除術、Roux-en-Y胃旁路術常規操作方法。

袖狀胃切除術：暴露胃組織，離斷肝胃韌帶、脾胃韌帶，沿大彎側分批離斷結扎網膜血管弓及胃短血管，分別于胃大彎側距幽門5 mm處、his角上下兩點，沿胃小彎走形各夾閉一把無損傷血管鉗，沿血管鉗離斷并移除約70%～80%大彎側胃組織，包含全部胃底。切緣消毒后用無菌縫線(大鼠用5-0或6-0；小鼠用9-0)間斷縫合切緣，徹底止血。將殘留胃回置原位。逐層關閉腹膜、肌肉、皮膚，完成袖狀胃手術操作。也有學者在對胃行袖狀切除之前，切開胃組織置入支撐管，以避免殘胃通道狹窄[26]。

Roux-en-Y胃旁路術：進入腹腔后，分離暴露胃腸組織，首先建立近端胃小囊，即從小彎側賁門下1 mm處至大彎側平分胃大彎中點到his角處離斷胃腔，使近端殘胃容積占比全胃的20%～30%左右。然后treitz韌帶遠端10～20 cm(大鼠)、4 cm(小鼠)處離斷小腸。遠端小腸與近端胃小囊于大彎側胃前壁或胃后壁行側側吻合。近端小腸與胃腸吻合口遠端10～20 cm(大鼠)、6 cm(小鼠)處小腸行端側吻合。胃-腸及腸-腸吻合口一般采用6-0線(大鼠)、9-0線(小鼠)間斷縫合，針距1 mm左右。各吻合口直徑多取0.5～1.0 cm大小。徹底止血、沖洗腹腔后逐層關腹，術畢?，F行動物實驗中，不少學者在建立胃小囊時采用6-0絲線捆扎或縫扎來隔斷近、遠端胃腔，取代直接離斷胃組織，以降低胃腸內容物污染、腹腔感染的機率。

圍手術期的觀察處理對術后動物的存活至關重要。術前30 min及術后前3 d常需肌注抗生素預防感染、皮下注射生理鹽水(每次0.5 mL/kg，每天1～2次)維持水電解質平衡。術后24 h禁食水，術后第2、3天口服葡糖糖注射液，3 d后流質飲食，逐步過渡到正常飲食。術后及時觀察、對癥處理是影響動物存活的重要因素。

3 影響代謝手術動物模型制備的因素

文獻報道袖狀胃切除術動物模型建模成功率約為70%～95.24%[11, 25, 27]，Roux-en-Y胃旁路術建模成功率約為50%～83.34%[9, 11, 30, 32-33]，造成術中術后動物死亡的主要原因包括麻醉過深、出血、水電解質紊亂、腹腔感染、吻合口梗阻、吻合口瘺、胃腸道缺血壞死等。影響術后動物存活即造模成功的因素，主要有以下幾點：

3.1 麻醉及手術操作技能

安全適度的麻醉方法與嫻熟高效的手術操作技能對動物實驗的成功開展至關重要。麻醉過淺影響手術進程，麻醉過深易致動物麻醉藥中毒。熟練的手術技能是成功建立動物手術模型的核心要素。富有經驗的手術操作，能夠明顯降低術中出血、吻合口梗阻、吻合口瘺的機率，有效保護術區組織器官血供，縮短手術時間。因此，初涉動物實驗的科研人員進行培訓、開展預實驗十分必要。結合相關資料，通過預實驗可以摸索實驗動物的理想麻醉條件、學習實驗動物的生理解剖特點、鍛煉手術操作技能。

3.2 科學合理的圍手術期支持措施

圍手術期密切觀察實驗動物并給予合理的對癥支持，可有效降低手術并發癥的發生率。如術前30 min及術后3 d肌注抗生素可有效預防控制感染；術中及術后3 d皮下注射適量生理鹽水有利于避免動物脫水，維持水電解質平衡；術前及術后適當時間的禁食水可減少腹腔感染、吻合口瘺的發生。

3.3 完備的動物實驗平臺

良好的動物飼養條件、清潔的手術操作平臺、充足的無菌手術器械耗材、規范的動物實驗管理流程等，可為代謝手術動物模型的成功建立提供很大的便利。

4 代謝手術模型在科學研究中的應用

鑒于代謝手術可顯著改善患者肥胖、糖尿病、高血壓病、高脂血癥等代謝紊亂病理狀態，而其具體機制尚不明確，代謝手術動物模型便被廣泛用于相關基礎科學研究[12]，主要有以下幾點：

4.1 用于不同代謝手術方式改善代謝紊亂效果的研究

不同方式的代謝手術，均有減重降糖的效果，動物實驗成為研究對比不同術式改善代謝效果的重要手段。Abegg等[34]利用ZDF大鼠代謝手術模型，發現袖狀胃切除術或Roux-en-Y胃旁路術聯合術后胰島素的降糖減重效果明顯優于藥物強化治療和飲食控制。Zheng等[24]利用飲食誘導的肥胖小鼠(C57BL/6J)建立代謝手術模型，發現Roux-en-Y胃旁路術在減輕體重、控制血糖方面與垂直袖狀胃切除術相比具有優勢。

4.2 用于探索代謝手術減重降糖機制的研究

Erika等[35]研究ApoE3L.CETP小鼠手術模型，再次明確了RYGB可以明顯改善小鼠糖脂代謝，其中血甘油三酯、總鞘磷脂的降低及胰島素抵抗的改善依賴于體重的降低，而血總膽固醇、非高密度脂蛋白、總神經酰胺的降低則為RYGB術特發性的改變，與體重的降低無關。Andrew等[36]利用SD大鼠建立RYGB和RYGB+迷走神經肝支離斷模型，發現RYGB所致的體重降低、食欲改變、能量消耗與肝迷走神經活動無關。Méndez-Giménez等[37]發現大鼠行袖狀胃切除術后水通道蛋白-7的表達上調，通過胰高血糖素樣肽-1促進胰島素的釋放，改善胰島素抵抗。郭偉等[38]研究發現RYGB術后肥胖大鼠腎糖異生關鍵酶表達下調、糖異生活動減弱，可能是手術改善大鼠糖代謝與胰島素抵抗的機制之一。Feng等[39]以自發性糖尿病小鼠為研究對象，在其尚未發病時實施預防性的袖狀胃切除術，發現袖狀胃切除術可以改善小鼠胰島細胞功能，并且這種作用與胰高血糖素樣肽-1有關。

4.3 用于探索代謝手術改善其他臟器功能的研究

由肥胖、2型糖尿病引起的代謝紊亂，往往導致多種代謝相關性疾病，如高血壓病、高脂血癥、脂肪肝、睡眠呼吸暫停綜合征、多囊卵巢綜合征、勃起功能障礙等，而代謝手術亦可明顯減輕上述疾病病理狀態[40-41]，推測其與代謝手術改變體內不同激素水平有關，但具體機制尚不明確。在動物實驗水平，研究代謝手術對心血管、腎、生殖等系統的影響也是當前熱點[12]。洪杰等[42]研究十二指腸空腸旁路術與全胃Roux-en-Y吻合術對SD大鼠水鈉平衡的影響，發現胃轉流術后SD大鼠24 h飲水量、尿量、尿鈉明顯增加，從電解質角度提供了代謝手術影響血壓的研究方向。Zhang 等[43]研究發現袖狀胃切除術和十二指腸-空腸旁路術可以通過抑制內質網應激，減少心肌細胞凋亡，改善糖尿病大鼠的心功能。此方面尚有許多研究，在此不贅述。

5 總結與展望

代謝手術良好的臨床治療效果、尚未明確的機制促使動物水平開展相關研究成為熱點。利用大鼠、小鼠、豬等常用實驗動物，已形成代謝手術常見術式的動物模型，且在醫學研究中廣泛應用。目前關于判斷代謝紊亂如糖尿病模型成功與否，以及代謝手術曠置腸管長度尚缺乏統一的標準。如何確立不同動物代謝紊亂的標準、手術離斷胃腸道的具體位置，更好的模擬人類代謝性疾病的病理生理狀態、手術帶來的具體影響，是未來建立代謝手術動物模型尚需進一步探索的課題。