虹鱒HMGCR基因克隆及組織差異表達分析

陳路斯 王震 張劍偉 張新黨 王恒志 林貝貝 鄧君明

摘要[目的]闡述虹鱒β-羥-β-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）基因的mRNA序列，并比較其在虹鱒不同組織器官中的表達差異。[方法]通過PCR技術擴增虹鱒HMGCR基因的mRNA序列，采用熒光定量PCR技術，比較HMGCR基因在虹鱒肝臟、腸道、胃、心臟、鰓、脾臟、腎臟、肌肉8種組織器官中的表達差異。[結果]虹鱒HMGCR基因的mRNA序列與大西洋鮭的同源性達97%，其蛋白序列與脊椎動物的同源性都在70%以上，表明該基因在物種進化過程中比較保守;該基因在虹鱒肝臟、腸道、胃、心臟、鰓、脾臟、腎臟、肌肉8種組織器官中均有表達;其中，該基因在肝臟和心臟中的表達量較高，而在胃中的表達量最低。[結論]該研究克隆出虹鱒膽固醇合成關鍵限速酶HMGCR的部分mRNA序列，分析了該基因在不同組織中的表達情況，為該酶的深入研究奠定基礎。

關鍵詞虹鱒;HMG-CoA還原酶;基因克隆;組織差異表達;熒光定量PCR

中圖分類號S?917.4文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0095-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.024

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Cloning and Tissue Differential Expression Analysis of HMGCR Gene in Oncorhynchus mykiss

CHEN Lu-si，WANG Zhen，ZHANG Jian-wei et al（College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kun-ming，Yunnan 650201）

Abstract[Objective]The purpose of this study was to reveal the mRNA sequence of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase （HMGCR） and compare the gene expression levels in different tissues of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）.[Method]The partial sequence of HMGCR gene was amplified by PCR technology and the gene expression differences among tissues such as liver，intestine，stomach，heart，gill，spleen，kidney and muscle were revealed by fluorescence quantitative PCR technology.[Result]The amino acid sequence shared 97% homology with Salmo salar，and the deduced protein sequence shared more than 70% homology with vertebrate，indicating that the gene was more conservative in the process of species evolution.The gene expression could be detected in the liver，intestines，stomach，heart，gill spleen，kidney and muscle of rainbow trout.The expression level of HMGCR gene in liver and heart was the highest，whereas which was the lowest in the stomach.[Conclusion]We cloned the partial RNA sequence of HMGCR，a key rate-limiting enzyme for cholesterol synthesis in rainbow trout，and analyzed the expression of HMGCR in different tissues，which laid a foundation for further study of the enzyme.

Key wordsOncorhynchus mykiss;HMGCR;Gene cloning;Tissue differential expression;Real-time PCR

膽固醇是一種以環(huán)戊烷多氫菲為母體的固醇類衍生物，主要以游離膽固醇和膽固醇酯的形式存在于動物組織細胞中。膽固醇不僅是構成生物膜的重要成分，同時也是生物體內(nèi)合成多種類固醇激素與維生素D的前體，還可以作為膽汁酸生物合成的原料[1-3]。然而，不同動物合成膽固醇的能力存在顯著差異，蝦蟹等甲殼動物不具備自身合成膽固醇的能力[4-5]，其體內(nèi)膽固醇必須從外界攝取;大部分脊椎動物體內(nèi)膽固醇主要來自于組織細胞的自身合成[6]。膽固醇合成可分為3個階段：碳單位甲羥戊酸合成、鯊烯合成、膽固醇生成[7]。乙酰CoA是膽固醇合成的直接原料，主要來自于葡萄糖、脂肪以及某些氨基酸的代謝，其中TCA循環(huán)是直接供給途徑[8]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原生成甲羥戊酸是膽固醇合成的限速步驟，其中催化HMG-CoA發(fā)生還原反應的β-羥-β-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）是這一步驟的關鍵酶，也是內(nèi)源性合成膽固醇的關鍵限速酶[9]，其活性將直接影響著膽固醇的合成速度。

HMGCR基因表達與酶活性受激素水平的調控[10]。試驗表明，甲狀腺激素[11]、胰島素[12]可以提高HMGCR基因的轉錄水平，而胰高血糖素則會降低該基因的轉錄[13]。糖皮質激素和雌激素通過影響HMGCR的穩(wěn)定性來調節(jié)膽固醇的合成量[6]。HMGCR酶活性除受到激素影響外，還受自身膽固醇含量的反饋調節(jié)[14]。當細胞中膽固醇含量較高時，會抑制該酶活性，從而減少內(nèi)源性膽固醇生成量。過高膽固醇含量也會加快該酶的降解，使細胞內(nèi)膽固醇含量達到平衡，這種降解反應依賴于跨膜區(qū)的泛素蛋白酶途徑[15]。與此相反，當細胞中膽固醇含量較低時，該酶活性就會被激活，從而促進內(nèi)源性膽固醇生成。體外試驗表明，膽固醇能在轉錄水平上調節(jié)HMGCR[15]，當細胞中膽固醇含量較低時，內(nèi)質網(wǎng)上的SCAP/SREBP復合物在SCAP護送下進入高爾基體復合體，在位點1蛋白酶和位點2蛋白酶的作用下，該復合物釋放SREBP前體，SREBP進入細胞核中，并與固醇反應元件結合，從而促進HMGCR基因的轉錄;當細胞中膽固醇含量較高時，SREBP只能停留在內(nèi)質網(wǎng)上，無法進入細胞核中，同時那些已經(jīng)進入到細胞核中的SREBP也會被分解，無法與固醇反應元件結合，從而阻止HMGCR基因的轉錄[16-17]。研究表明，不同動物的調節(jié)方式可能不同，有些是在翻譯水平上調節(jié)（如大鼠），有些則是在轉錄水平上調節(jié)（如倉鼠和?小鼠）[17]。

大量研究表明，膽固醇合成代謝與魚類健康有著密切關系[1]。HMGCR作為合成內(nèi)源性膽固醇的關鍵限速酶，越來越引起人們的關注。目前，人、鼠、雞、鴨、鵝等陸生動物以及斑馬魚、草魚等水生動物HMGCR基因序列已被成功克隆[18-19]。該研究應用PCR方法克隆出虹鱒膽固醇合成關鍵限速酶HMGCR的部分mRNA序列，旨在為該酶的深入研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料試驗用虹鱒（Oncorhynchus mykiss）來自當年人工培育的同一批苗種，同種飼料飼喂。隨機選取3條規(guī)格一致（80 g左右）虹鱒，于超凈工作臺中采集肝臟（Hep）、腸道（Int）、胃（Sto）、脾臟（Spl）、腎臟（Kid）、肌肉（Mus）、鰓（Gil）、心臟（Hea）8種組織，裝入用0.1%DEPC水溶液預處理過的凍存管中，快速投入液氮中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1RNA提取及反轉錄。使用RNA提取試劑（Trizol Reagent）提取總RNA。試驗過程中應嚴格防止RNase污染。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測其完整性，Nano Vue微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。為除去總RNA中所摻雜的基因組DNA，取1 μL總RNA，加入2 μL 5×DNA Eraser Buffer，用RNase Free dH2O補足至反應體系為10 μL，42 ℃下反應?2 min后置于4 ℃中保存。取10 μL上述反應液，加入4 μL ?5×Prime script buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix和?1 μL RT primer Mix，用RNase Free dH2O補足反應體系至?20 μL，37 ℃下反轉錄15 min，合成cDNA，85 ℃下反應5 s后于4 ℃條件下保存。

1.2.2簡并引物的PCR擴增及產(chǎn)物測序。根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫中大西洋鮭（Salmo salar）（NP001167390.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（AEO44579.1）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）（AAR02862.2）和斑馬魚（Danio rerio）（AAI55136.1）4個物種的核酸序列，利用引物在線設計軟件CODEHOP（http：//blocks.fhcrc.org/codehop.html）設計簡并引物。經(jīng)Blast比對后，挑選簡并度較低的引物送交上海生工生物工程股份有限公司進行合成。以HMGCR-U1和HMGCR-D1為引物（表1），進行PCR擴增。RCR產(chǎn)物經(jīng)?1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Gel Extraction UF Kit）進行切膠回收。取純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將擴增到的序列在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，并對其序列進行生物信息學分析。根據(jù)簡并引物PCR擴增到的片段在NCBI網(wǎng)站中的Blastn比對結果，得到第一段mRNA序列。參考大西洋鮭mRNA序列，設計同源引物HMGCR-F1和HMGCR-R1（表1），進行PCR擴增取純化后PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因進行測序。將得到的結果在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對，得到第2段mRNA序列。借助DNASTAR Lasergene7生物軟件，對所得2個片段進行合并，并對合并后的片段進行生物信息學分析。

1.2.3各組織HMGCR表達量的測定。利用Trizol（Invitrogen）法提取虹鱒肝臟（Hep）、腸道（Int）、胃（Sto）、脾臟（Spl）、腎臟（Kid）、肌肉（Mus）、鰓（Gil）、心臟（Hea）8種組織總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄，獲得cDNA第一模板鏈，作為熒光定量PCR模板，根據(jù)已獲得的HMGCR基因序列，借助生物軟件DNASTAR Lasergene7 PrimerSelect設計并篩選HMGCR SYBR Green Ⅱ 實時熒光實時定量 PCR引物，以β-actin為內(nèi)參，進行相對定量（表2）。熒光定量 PCR 采用 SYBR Green Ⅱ 嵌合熒光法，所用試劑為SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time，TaKaRa，日本），反應在Thermal cycler （Mastercycler ep realplex，Eppendorf，德國）儀器中進行。PCR反應體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，cDNA 1 μL，上下游特異性引物（10 mmol/L）各1 μL，DEPC-H2O 7 μL。熒光定量PCR反應程序如下：95 ℃預變性2 min;94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火35 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參，其中內(nèi)參其因的退火溫度為60 ℃。每個組織設3個平行組，基因相對mRNA水平采用 2-ΔΔCt法檢測。所有試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示。采用單因素方差分析（ANOVA），當各處理組間存在顯著差異（P<0.05）時，采用Duncans檢驗進行多重比較分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行。

[2]SHEEN S S.Dietary cholesterol requirement of juvenile mud crab Scylla serrata[J].Aquaculture，2000，189（3）：277-285.

[3]KLIEWER S A，MOORE J T，WADE L，et al.An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway[J].Cell，1998，92（1）：73-82.

[4]汪留全，李海洋，胡王，等.飼料中膽固醇水平對幼蟹生長和飼料利用率影響的研究[J].淡水漁業(yè)，2004，34（1）：13-15.

[5]溫小波，陳立僑.磷脂和膽固醇在蝦蟹類營養(yǎng)中的研究進展[J].淡水漁業(yè)，2000，30（5）：25-27.

[6]安光全.雞HMGCR基因多態(tài)性與血清VLDL濃度和繁殖性狀的關聯(lián)研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2010：1-5.

[7]魏楊.雞HMGCR基因多態(tài)性及其與經(jīng)濟性狀相關性研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2012：4-6.

[8]叢日華.品種和母豬日糧蛋白水平對仔豬肝臟膽固醇代謝的影響及其機制[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2011：2-4.

[9]黃雨薇.氧化魚油、丙二醛對草魚（Ctenopharyngodon idellus）肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝的影響[D].蘇州：蘇州大學，2015：2-4.

[10]NESS G C，WIGGINS L，ZHAO Z H.Insulin increases hepatic 3-hydroxy-methylglutaryl coenzyme A reductase mRNA and immunoreactive protein levels in diabetic rats[J].Archives of biochemistry & biophysics，1994，309（1）：193-194.

[11]LATOUR M A，PEEBLES E D，DOYLE S M，et al. Broiler breeder age and dietary fat influence the yolk fatty acid profiles of fresh eggs and newly hatched chicks[J]. Poult Science， 1998， 77（1）：47-53.

[12]NESS G C，LOPEZ D，CHAMBERS C M，et al.Effects of L-triiodothyronine and the thyromimetic L-94901 on serum lipoprotein levels and hepatic low-density lipoprotein receptor，3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，and apo A-I gene expression[J].Biochemical pharmacology，1998，56（1）：121-129.

[13]李平華，黃陽，賀麗春，等.不同來源油脂及劑量對仔豬生長性能和血清脂質指標以及肝臟膽固醇代謝的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2017，40（4）：710-717.

[14]PLAT J，MENSINK R P.Relationship of genetic variation in genes encoding apolipoprotein A-IV，scavenger receptor BI，HMG-CoA reductase，CETP and apolipoprotein E with cholesterol metabolism and the response to plant stanol ester consumption[J].European journal of clinical investigation，2015，32（4）：242-250.

[15]SONG B L，DEBOSEBOYD R A.Ubiquitination of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in permeabilized cells mediated by cytosolic E1 and a putative membrane-bound ubiquitin ligase[J].Journal of biological chemistry，2004，279（27）：28798-28799.

[16]魏健，江路易，宋保亮.膽固醇的內(nèi)源合成與小腸吸收[J].生命科學，2015，27（7）：847-858.

[17]NESS G C，HOLLAND R C.Degradation of HMG-CoA reductase in rat liver is cholesterol and ubiquitin independent[J].FEBS Letters，2005，579（14）：3126-3130.

[18]DUCKWORTH P F，VLAHCEVIC Z R，STUDER E J，et al. Effect of hydrophobic bile acids on 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase activity and mRNA levels in the rat[J]. Journal of biological chemistry，1991，266（15）：9413-9414.

[19]BAKKER-ARKEMA R G，DAVIDSON M H，GOLDSTEIN R J，et al.Efficacy and safety of a new HMG-CoA reductase inhibitor，atorvastatin，in patients with hypertriglyceridemia[J].Jama the journal of the American medical association，1996，275（2）：128-133.

[20]甘玲.畜禽膽固醇合成關鍵酶HMGR的生物信息學分析[J].中國畜牧雜志，2010，46（7）：5-8.

[21]鄒思湘.動物生物化學[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：201-205.

[22]黃艷玲，羅緒剛.飼糧脂肪酸會對脂肪代謝酶有關基因表達的影響[J].動物營養(yǎng)學報，2005，17（4）：1-5.

[23]郭曉強，郭振清.SREBP介導的膽固醇生物合成反饋調節(jié)[J].生命的化學，2007，27（4）：292-293.

[24]王曉鳳.豬HMGR基因的克隆、表達、染色體定位及多態(tài)性分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學，2006：90-91.

[25]LANGE Y，STECK T L，YE J，et al.Regulation of fibroblast mitochondrial 27-hydroxycholesterol production by active plasma membrane cholesterol[J].Journal of lipid research，2009，50：1881-1888.

[26]張燕萍，鐘杰，周秋白，等.黃鱔PLA2基因的克隆及表達分析[J].淡水漁業(yè)，2017，47（3）：16-24.

[27]LANGE Y，YE J，STECK T L.Activation of membrane cholesterol by displacement from phospholipids[J].Journal of biological chemistry，2005，280：36126-36131.