麥洼牦牛PRL基因多態與產奶性狀的關聯分析

李鑄 何世明 吳錦波 艾鷖 蹇尚林 劉建 雍軍

摘要研究旨在了解麥洼牦牛催乳素（PRL）基因的單核苷酸多態性（SNP），探究與牦牛產奶性能相關的分子標記。通過對PCR產物進行直接測序篩選麥洼牦牛PRL基因的SNP位點，運用DNAMAN和SPSS等軟件對PRL基因型與產奶性狀進行了統計分析。結果表明，位于PRL基因996 bp處發現一個疑似SNP位點，該位點T堿基缺失突變;對比麥洼牦牛不同PRL基因型的產奶性狀，突變型個體的?153 d產奶量、乳蛋白質率、乳糖率和乳中的體細胞數均下降（ P>0.05），而乳脂率則顯著升高（P<0.05），暗示該處堿基T堿基缺失對乳中脂肪含量有顯著影響。

關鍵詞牦牛;PRL基因;SNPs;產奶性狀;關聯分析

中圖分類號S?823.8+5文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0108-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.028

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Correlation Analysis on Polymprphism of Prolactin Gene with Milk Performance Traits in Maiwa Yak

LI Zhu，HE Shi-ming，WU Jin-bo et al（Institute of Animal Science and Technology of Aba Tibetan and Qiang Autonomous Prefecture， Hongyuan，Sichuan 624402）

AbstractIn order to study the single nucleotide polymorphism （SNP） of the Maiwa yak prolactin gene and to explore the molecular markers related to milk performance traits of yak. We used the direct PCR sequencing method to screen the SNPs， and analyzed the correlation between prolactin genotype and milk performance traits by employing statistical softwares such as DNAMAN and SPSS.The results showed that we found one SNP site which located at 996 bp of prolactin gene and its T-base deletion mutation at this site. By comparing the milk performance traits of different prolactin gene types， the 153 d milk yield， lactoprotein， milk sugar and somatic cell number in milk of mutant individuals were lower than normal genotype individuals （P>0.05）， while the milk fat increased significantly （P<0.05）. It was suggested that the absence of T-base had a significant effect on the fat content of Maiwa yak milk.

Key wordsMaiwa yak;Prolactin gene;Single nucleotide polymorphism;Milk performance traits;Correlation analysis

麥洼牦牛屬于草地型牦牛，主產于位于川、甘、青3省結合部的四川省紅原縣麥洼、瓦切鄉和若爾蓋縣包座鄉等地區，中心產區在紅原縣麥洼地區，在周邊的黑水縣、阿壩縣、壤塘縣、九寨溝縣和松潘縣等地區也有分布[1]。麥洼牦牛是青藏高原的地方優良品種， 具備乳、肉兼用的種質特性， 已被列入《中國牛品種志》和《四川家畜家禽品種志》[2]。我國現有飼養量約170萬頭，占全國牦牛總數的11%，具有適應性好、產乳性好、乳脂率高和馱力大等優點，不僅是我國著名奶肉兼用型地方優良品種，還是牦牛遺傳資源寶庫中珍貴的種質資源和基因庫[3]。

催乳素（prolactin， PRL）是由199個氨基酸殘基組成的一種蛋白質，由腺垂體分泌，其主要功能是促進乳腺發育，引起和維持泌乳。牦牛PRL基因全長為9 647 bp，可轉錄出X1、X2和X3三型催乳素，其中X1型和X2型催乳素基因均由5個外顯子組成，而X3型催乳素基因由4個外顯子組成。PRL通過與靶細胞膜表面的催乳素受體結合，啟動JAK2/STAT5信號轉導途徑，最終激活反式作用因子STAT5，使其作用于乳蛋白基因啟動子區的靶序列，啟動或增強以乳蛋白基因啟動子為作用元件的靶基因的表達[4]。此外，PRL基因還在個體生殖生理調控、應激反應、免疫活動及滲透壓調節、神經系統信號傳遞等方面具有一定的作用，被認為是對奶牛泌乳性能具有重要作用的候選基因。

近年來研究發現，催乳素基因對哺乳動物的乳腺發育和泌乳具有影響作用，尤其是與產奶量和乳成分呈正相關，因此成為學者們的研究熱點。例如，在PRL基因全序列克隆方面，有學者采用Long PCR等方法克隆得到全長?9 388 bp的牛催乳素基因組序列[5]，而后利用亞克隆的方法構建該基因組的pcDNA3.1（+）/ bPRL重組表達載體并轉染COS-7細胞，結果通過RT-PCR成功擴增到了預期目的片段，證實了該基因組DNA在轉錄水平上的生物學功能[6];有學者以PRL基因外顯子為研究對象，分別對第2[7]、第3[8]和第4[9]這3個外顯子的群體遺傳特征進行了相應分析。而對于牛PRL基因與泌乳性狀之間的相關性，學者們也進行了大量的研究，有學者綜述了PRL的結構與功能、基因定位及作用機制、PRL上的SNPs與產奶性狀關系等幾個方面的內容[10];有學者采用PCR-RFLP技術檢測分析了荷斯坦奶牛催乳素基因的多態性，結果檢測到AA、AB、BB這3種基因型[11];國外學者如Mehmannavaz等[12]、Alfonso等[13]研究也證實PRL基因與產奶性狀之間具有很大相關性。

目前已有對麥洼牦牛基因SNPs的部分研究，但對PRL基因單核苷酸多態性的研究還鮮見報道。近年來，阿壩州畜牧科學技術研究所與西南民族大學、四川省草原科學研究院、阿壩州畜牧工作站等單位合作，在紅原縣開展麥洼牦牛高產奶新品系選育工作。筆者以PCR法和測序法研究牦牛催乳素基因單核苷酸多態性，探討與牦牛產奶性狀之間的相關性，旨在為麥洼牦牛高產奶品系選育工作提供參考和為進一步確定催乳素基因功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

于阿壩州紅原縣瑪莎村、熱多村和澤木科3個區域隨機抽取活潑健康、體形正常的2～4胎次母牦牛49頭，并記錄其耳號。于2017年6—10 月清晨牧民擠奶時測定日擠奶量，每10 d測定一次，指標測定和記錄均分別由專人進行。擠奶量測定期間同時采用無菌注射器采集麥洼牦牛血樣，共取得血樣49份，盛裝于無菌15 mL離心管中。血樣現場暫存于冰盒中，后保存于-60?℃超低溫冰箱中待用。

1.2主要試劑

血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp Genomic DNA Kit，50preps離心柱型）產自天根生化科技（北京）有限公司;PCR反應體系配制使用的2×Taq PCR Mastermix購自天根生化科技（北京）有限公司;Trizma base， Brotic acid和EDTA等試劑均產自VETEC公司;核酸染料Goldview 購自博奧拓達科技（北京）有限公司。

1.3DNA提取和檢測

采用血液基因組DNA提取試劑盒提取麥洼牦牛血樣DNA。血樣于-60 ℃冰箱中取出后放置于水中解凍，再按照DNA提取試劑盒中提供的說明書步驟進行操作，提取DNA產物放置于-20 ℃冰箱中備用。制備1%瓊脂糖凝膠，用移液槍吸取1 μL的6×Loading buffer，與?4 μL DNA產物在PE手套上混勻，再吸取混勻后的液體加入瓊脂糖凝膠板上的點樣孔內，旁邊點上Marker DNA 4 μL，?121 V條件下電泳40 min，再通過照膠儀于紫外光下檢測DNA純度，對有雜帶或純度不高的樣品重新提取血液DNA并進行檢測。

1.4引物合成和PCR擴增

參考文獻[9]中對水牛PRL基因多態性的研究，設計一對引物序列用于樣品中PRL基因的擴增，引物序列為F：5-AAGCCTTTTACATTATTTCAACCC-3，R：5-AATTCTCTGACCTCA AGCCACTCT-3，引物由上海英濰捷基公司合成。PCR擴增產物長度為1 103 bp。

PCR反應體系25 μL：包括DNA模板1 μL，上下游Primer各1 μL，2×Taq PCR Mastermix（含染料）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環;72 ℃終延伸5 min;4 ℃保存。制備1%瓊脂糖凝膠，PCR反應結束后取5 μL產物電泳40 min后，于紫外燈下觀察其擴增結果。合格PCR產物保存于-20 ℃冰箱中，以待測序。

1.5SNP篩選和序列分析

按照測序要求準備PCR產物及引物，直接寄送英濰捷基貿易有限公司（廣州實驗室）進行雙向測序。測序返回的正反向序列，運用DNAMAN 5.0對擴增序列的測序結果與NCBI上參考目的片段序列進行比對并校正拼接;使用Chromas軟件對測序峰圖進行分析，篩選獲得SNPs位點。

1.6統計分析

運用DNAMAN5.0對序列進行校正和比對分析，測序峰圖采用Chromas軟件進行分析，利用SPSS 21.0軟件比較樣本類群間2種基因型和產奶量之間的關聯性，并進行顯著性檢驗（P<0.05為顯著性差異，P<0.01為極顯著性?差異）。

2結果與分析

2.1麥洼牦牛基因組DNA提取與檢測

采用紫外分光光度計對提取的麥洼牦牛血液基因組DNA進行純度檢測，濃度均在100 ng/μL以上，DNA樣品測定的OD?260/OD?280比值均在1.6～1.8，符合要求。經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖1），在紫外燈照射下基因組DNA條帶明亮單一，表明所提DNA樣品濃度質量好，可以用于展開后續的PCR試驗。

2.2牦牛PRL基因PCR擴增產物檢測

根據設計引物對麥洼牦牛PRL基因的5側翼調控區序列進行擴增，擴增出的麥洼牦牛PRL基因序列長度為1 103 bp，產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外燈照射下結果均和目的片段大小相一致，條帶單一且清晰（圖2），可用于測序分析。

2.3牦牛PRL基因SNPs的篩查和檢測

擴增產物經膠回收純化后進行正反雙向測序，均由測序公司完成。采用DNAMAN 5.0軟件拼接原始序列，并對測序峰圖進行分析，共篩查到1個疑似SNP位點，位于目標基因序列的998 bp處，正常序列為5-ATGAAATG-3，突變序列為5-A_GAAATG-3，該處堿基T缺失。進一步比對全部樣本的測序結果，共計29個樣本中發現了該位點處T堿基缺失，初步確定為SNP位點。

2.4PRL基因多態性與牦牛泌乳性狀的相關性

將所有樣本按照突變型（T堿基缺失）和正常型分為2組，對2種基因型下牦牛153 d產奶量、乳脂、乳蛋白、乳糖和體細胞數等進行相關分析。表1顯示了PRL基因不同基因型對麥洼牦牛產奶性狀的影響。從表1可以看出，經檢驗分析，2種基因型下牦牛產奶性狀存在一些差異，部分指標差異顯著（P0.05），特別的，乳脂率在PRL基因998 bp處T堿基缺失后顯著升高了（P<0.05），暗示該處T堿基缺失對乳中脂肪含量有顯著影響。

3討論

PRL基因與乳脂等泌乳性狀極度相關，也是奶牛產奶性狀的主要候選基因，但目前對牦牛催乳素基因SNPs的研究還較少。該研究于阿壩州紅原縣搜集了49個麥洼牦牛的血液樣本，并提取DNA和設計引物，再通過直接測序法篩選PRL基因的疑似突變位點，以期找出與麥洼牦牛泌乳性狀相關的SNPs。對測序結果分析后發現有29個樣本于PRL基因996 bp處T堿基突變缺失，且該位點突變對牦牛產奶性狀有顯著影響，但目前該種基因型的個體數量較少，因此在后續的研究中有必要進一步擴大樣本群體來加以驗證。經統計分析，這種T堿基突變型對乳脂的含量有顯著影響，因此有可能作為影響麥洼牦牛產奶性狀的一個重要候選基因型進行分子遺傳標記，進而應用到麥洼牦牛高產奶群的選育工作中。

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