辣木離體再生體系的建立

陳麗文 時群 陳乃明 何貴整 吳紅英

摘要以辣木種子為外植體，誘導獲得無菌苗，然后通過用無菌苗的嫩莖誘導愈傷組織分化不定芽，再將不定芽誘導生根，獲得完整植株，建立辣木的離體再生體系。結果表明，適合辣木種子誘導無菌苗的培養基為 MS0，誘導率達95%;適合無菌苗莖段誘導愈傷組織的培養基為MS+2，4-D 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，誘導率達87.03%;適合愈傷組織分化不定芽及不定芽增殖的培養基為改良MS+6-BA?0.6 mg/L+IAA 0.2 mg/L，芽分化率達83.33%，芽增殖系數達4.2;適合不定芽生根的培養基為 1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L，生根率達92.7%，平均根數達5.78。

關鍵詞辣木;離體培養;再生體系

中圖分類號S?792.99文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0121-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.032

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Establishment of Regeneration System in vitro for Moringa oleifera Lam

CHEN Li-wen，SHI Qun，CHEN Nai-ming et al（Qinzhou Forestry Science Research Institute，Qinzhou，Guangxi 535099）

AbstractThe seeds of Moringa oleifera were used as explants to induce and obtain aseptic seedlings， and then the callus was induced to differentiate adventitious buds by using the tender stems of seedlings，then the adventitious buds were induced to take root to obtain complete plants and establish in vitro regeneration system.Results showed that culture medium MS0 was suitable for the seeds of M. oleifera to induce sterile seedings，the induction rate was 95%.The optimal callus induced medium was MS+2，4-D 0.8 mg/L+KT 0.2 mg/L，the induction rate was 87.03%.The optimal medium for adventitious buds differentiation and multiplication were modified MS+6-BA0.6?mg/L+IAA0.2?mg/L，the differentiation rate was 83.33%，the muitiplication coefficient was 4.2.The optimal rooting culture medium was 1/3MS+IBA0.5?mg/L+NAA?0.2?mg/L，the rooting rate was 92.7%，the average root number was 5.78.

Key wordsMoringa oleifera;in vitro culture;Regeneration system

辣木（Moringa oleifera Lam.）為辣木科辣木屬植物，又稱鼓槌樹，是一種有獨特經濟價值的熱帶植物，原產于印度北部[1]。辣木是目前已發現的最好植物蛋白、維生素A、葉酸、泛酸、鈣、鐵、硒等多種營養素的來源，其葉、果均有優良的食用和藥用價值，果實提取的植物油具有獨特的工業用途，是全球最熱門的高營養多用途植物，在很多國家都作為重要藥食和工業原料來利用，被譽為“植物中的鉆石”[2-5]。

目前，辣木主要的育苗方式是播種繁殖和扦插，不僅育苗周期長、繁殖系數低，會造成品種退化，而且易受季節氣候條件的限制[6]。通過離體快繁建立植株再生體系是解決辣木種苗繁殖的一種有效途徑，為辣木良種苗木的規?；a提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料選用辣木改良種PKM1的種子作為外植體材料，種子采自云南。

1.2方法

1.2.1無菌苗誘導。

選取顆粒飽滿的良種辣木種子，剝去外種殼，將種仁在超凈工作臺上以0.1%HgCl2溶液消毒?10 min，再用無菌水沖洗5遍，瀝干水后接種到初始誘導培養基上，放置在培養室用黑布遮蓋進行暗培養，待種子開始萌動，長出白色根，再掀開黑布繼續培養直至長成無菌小苗。

1.2.2愈傷組織誘導。

將獲得的無菌苗剪切成約1 cm小段，接種到愈傷組織誘導培養基上，每瓶培養基接入3個小段，每種培養基接種15瓶，接種時使切口與培養基相接觸，接種后放置在培養室用黑布遮蓋進行暗培養15 d，待愈傷組織形成后移到自然光條件下培養，30 d后統計愈傷組織的誘導率。

1.2.3不定芽誘導與增殖。

將長出的愈傷組織切下接種至不定芽誘導培養基上培養，每瓶培養基接種2個愈傷組織塊，每種培養基接種15瓶，接種后放在培養室用黑布遮蓋進行暗培養10 d，待不定芽萌出后移到自然光條件下培養，30 d后統計不定芽的誘導率，然后每隔30 d將不定芽轉接到適宜的培養基上進行增殖培養。

1.2.4生根誘導。

剪取生長健壯的不定芽接種至生根誘導培養基上，每瓶培養基接種10株小芽，每種培養基接種15瓶，接種后放在培養室內弱光條件下培養，待小苗的基部切口處長出根系后移到煉苗棚進行煉苗，煉苗15 d左右就可以進行生根苗的移栽。

1.2.5培養基及培養條件。

1.2.5.1培養基。基本培養基為MS培養基，根據不同培養階段的需要添加不同濃度的生長調節劑、防褐化劑、其他添加物等。培養基pH為5.8，誘導、增殖培養基每升添加3.8 g瓊脂粉、30 g白砂糖，生根培養基每升添加4.2 g瓊脂粉、20 g白砂糖。培養基在121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min。培養基取出后自然冷卻，待其凝固后即可使用。

1.2.5.2培養條件。

培養室溫度保持在（25±2）℃，空氣濕度為75%～85%，光照強度為2 000～3 000 lx，每天光照時間為12 h。

1.2.6數據處理。采用DPS數據處理系統對數據進行方差分析和LSD多重比較。

2結果與分析

2.1無菌苗誘導情況

通過辣木種子誘導獲取無菌苗比較容易，將經過消毒處理的辣木種仁接種到初始誘導培養基MS0（不加任何激素和添加物）中，暗培養7 d后種子開始萌動，長出長約1 cm的白色根，然后掀開黑布繼續培養3～5 d即可長出小苗，15～20 d無菌苗可長至3～4 cm，無菌苗的誘導率達95%。

2.2不同生長調節劑組合對辣木無菌苗莖段誘導愈傷組織的影響

將辣木無菌苗剪切成小段，接種到愈傷組織誘導培養基上培養10 d左右，莖段兩端慢慢翹起，莖段彎曲，莖段兩端切口部位開始出現少量愈傷組織，大約20 d，大部分莖段切口處形成愈傷組織，愈傷組織誘導情況見表1。

從表1可以看出，A4處理的無菌苗莖段愈傷組織的誘導率最高。統計分析表明，A4處理與其他處理均存在顯著差異。根據觀察結果可知，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織的誘導率也增高，但濃度過高容易導致愈傷組織表面出現老化現象。綜合比較看出，A4培養基的誘導率最高，愈傷組織生長也較好，愈傷組織質地致密，黃綠色。MS+2，4-D0.8 mg/L+?KT0.3 mg/L為適合愈傷組織誘導的培養基，誘導率達?87.03%，誘導出的愈傷組織生長狀況最好。

2.3不同無機鹽濃度及生長調節劑組合對辣木不定芽分化及增殖的影響

將無菌苗莖段切口長出的愈傷組織切下接種到芽分化培養基上培養，25 d左右愈傷組織塊上分化出不定芽，待芽高長到約3 cm時，將芽叢切下，接種至同樣的培養基上進行增殖培養。辣木不定芽分化及增殖情況見表2，對試驗結果進行統計分析，結果見表3、4。

從表3可以看出，不同無機鹽濃度的基本培養基對辣木不定芽分化及增殖的影響存在顯著差異，其中改良MS培養基的平均芽分化率和平均芽增殖系數更高，分別為63.33%和3.18;而且，以MS為基本培養基誘導分化的不定芽長出的葉片顏色偏黃，有掉葉的現象，而采用經過改良的MS作為基本培養基誘導的不定芽則比較健壯，長出的葉片顏色翠綠，這可能是由于改良MS培養基中適當提高了KH2PO4和鐵鹽的濃度，在培養基中提高磷酸根離子水平可抵消IAA對芽分化的抑制作用，增加芽的增殖率[7];而鐵鹽是培養基中用量較多的一種無機鹽類物質，對植物組織葉綠素的合成和延長生長起到重要的作用[8]。

從表4可以看出，同樣濃度的6-BA分別與NAA、IAA組合的培養基對辣木愈傷組織分化芽及芽的增殖效果不同，兩者之間存在極顯著差異，添加IAA的培養基愈傷組織誘導芽的分化率、增殖系數更高，芽生長也較好;此外，試驗發現，在同樣濃度的生長素組合下，隨著6-BA濃度的提高，不定芽會出現玻璃化、葉片卷曲的現象，因此，6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L為更好的生長調節劑濃度組合配比。

經綜合比較，改良MS+6-BA0.6 mg/L+IAA0.2 mg/L培養基比較適合辣木不定芽的分化和增殖，芽分化率達?83.33%、芽增殖系數達4.2，且芽生長健壯，葉片舒展、葉色?翠綠。

2.4不同無機鹽濃度及生長調節劑組合對辣木不定芽生根的影響

剪取生長健壯、長約3 cm的不定芽接種至生根誘導培養基上，放在培養室內弱光條件下培養，15 d后小苗的基部切口處開始長根。辣木不定芽生根情況見表5，對試驗結果進行統計分析，結果見表6、7。

從表6可以看出，不同無機鹽濃度的基本培養基對辣木不定芽生根的影響存在顯著差異，不同無機鹽濃度的基本培養基的生根效果為1/3MS>1/2MS>MS，可以看出辣木不定芽生根誘導需要較低的無機鹽濃度，以無機鹽濃度為1/3MS時的平均生根率和平均根數最高，分別為81.13%和4.36。所以，辣木不定芽生根選用1/3MS為基本培養基比較合適。

從表7可以看出，添加不同生長調節劑IBA、NAA及兩者組合的生根培養基對辣木不定芽生根的效果不同，其中以IBA和NAA組合的生根效果好，并與單獨添加IBA或NAA的生根效果存在極顯著差異。單獨添加同濃度的IBA或NAA的生根培養基的辣木不定芽生根率和平均根數差異不顯著，但從表5看，單獨添加IBA的生根培養基培養的小苗根系較細長、側根較少，單獨添加NAA的生根培養基培養的小苗根系較粗短、側根較多，而添加IBA與NAA組合的生根培養基培養的小苗根系粗壯、須根發達。因此，IBA?0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L為適宜辣木不定芽生根的生長調節劑組合。

經綜合比較，1/3MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.2 mg/L培養基比較適合辣木不定芽生根，生根率達92.7%，平均根數達?5.78，且根系粗壯、須根發達。

3討論

（1）外植體材料的選擇常常是組織培養獲得成功與否的關鍵。從理論上講，植物的任何組織或器官都能作為組織培養的外植體，但由于植物種類、生長階段、生理狀態、年齡、生長部位等不同，其無性繁殖能力也不一樣，同一植物不同的組織和器官其再生能力也有差異[9]。該試驗采用辣木種子作為外植體，誘導獲得無菌苗，再用無菌苗的莖段誘導愈傷組織，通過愈傷組織分化不定芽，最終形成完整植株。通過種子雖然能較快地獲得無菌材料，但須經過愈傷組織的途徑才分化獲得不定芽，過程相對較長。今后可嘗試以辣木苗嫩枝作為外植體，直接誘導獲得無菌芽進行繁殖，為辣木離體再生體系的建立提供更多的途徑。

（2）辣木對細胞分裂素特別敏感，在離體培養過程中極易產生玻璃化現象。玻璃化是在芽分化啟動后的生長過程，

由碳水化合物、氮代謝和水分狀態等發生生理性異常所引起，它受多種因素影響和控制，主要有溫度、光照、激素種類和濃度、瓊脂用量、酸堿度、糖濃度、碳氮比、乙烯等[10]。該試驗通過調節光照、激素濃度可以大大減少玻璃化苗的產生。

（3）在辣木離體培養過程中，無論是增殖培養還是生根培養，均很容易出現葉子黃化脫落的現象。該試驗通過提高鐵鹽的濃度，并調節瓊脂和蔗糖的用量可減少葉子黃化?脫落。

（4）在辣木不定芽生根培養時，將培養基中無機鹽濃度降低，可提高生根率，這種無機鹽濃度降低的功能雖不是十分明確，但培養基中的鹽濃度會影響到其滲透壓，從而影響到植物離體培養物的營養吸收和向培養基中釋放一些物質，促進植物生根。

參考文獻

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