馬鈴薯瘡痂病鏈霉新變種的分離與生物學(xué)特性分析

馬建榮 余永紅 黎敬鴻 陳力暢 何海林

摘要[目的]研究土壤中分離到C9菌株的種類歸屬和生物學(xué)特性。[方法]擴增C9菌株的16S rDNA序列，并進行系統(tǒng)發(fā)育建樹。檢測C9菌株對不同碳源、氮源的利用能力，以及對不同抗生素、滲透壓的敏感性。利用GC-MS法測定C9菌株的脂肪酸組分，并擴增其脂肪酸合成關(guān)鍵酶——3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）編碼基因，并進行序列同源性分析。[結(jié)果]基于C9菌株的16S rDNA序列分析，結(jié)合分析其菌落形態(tài)特征，初步判斷C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）。但C9菌株的生理生化特征與已報道的S.scabies菌株有明顯差異，進一步盆栽試驗結(jié)果顯示C9菌株不能引起馬鈴薯瘡痂病，其染色體上也沒有擴增獲得致病島（PAI）區(qū)域中致病性相關(guān)的基因，說明該菌株不具有馬鈴薯瘡痂病致病性，為Streptomyces scabies的一個新變種。C9菌株的脂肪酸組成測定結(jié)果顯示其主要合成棕櫚油酸（C?16∶1）和棕櫚酸（C?16∶0），其不飽和脂肪酸總含量達36.2%，也符合馬鈴薯瘡痂病非致病株的特征。C9菌株基因組中fabH基因序列和編碼的氨基酸序列與Streptomyces scabies都具有極高的一致性。[結(jié)論]C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌新變種。C9菌株為進一步深入研究馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌的基礎(chǔ)代謝機制或探索其致病機理提供了良好的材料。

關(guān)鍵詞馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌;?16S rDNA;?脂肪酸組成

中圖分類號S?182;Q?93文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0139-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.037

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Isolation and Biological Characteristics Analysis of a New Variety of Streptomyces Potato Scab

MA Jian-rong，YU Yong-hong，LI Jing-hong et al （Guangdong Food and Vocational College，Guangzhou，Guangdong 510520）

Abstract[Objective]To study the biological characteristics and classify the C9 strain isolated from soil.[Method]The 16S rDNA sequence of the C9 strain was amplified and phylogenetical tree was established.The ability of C9 strain to utilize different carbon sources and nitrogen sources，as well as sensitivity to osmotic pressure and different antibiotics，was examined.The fatty acid composition of C9 strain was determined by GC-MS，and the gene encoding the key enzyme for fatty acid synthesis，3-ketoacyl-ACP synthase III （FabH），was amplified and sequence homology analysis was performed.[Results]The C9 strain was classified as Streptomyces scabies based on the 16S rDNA sequence coupled with the colony morphology.However，the physiological and biochemical characteristics of the C9 strain were significantly different from those of the reported S.scabies strains.Moreover，the C9 strain showed no pathogenicity to cause potato scab by the pot tests，and the genes related to pathogenicity in PAI region were not amplified on its chromosome.All the results indicated that C9 strain was a new strain of Streptomyces scabies.The fatty acids composition of the C9 strain was analyzed further.The results showed that the strain mainly synthesized palmitoleic acid （C?16∶1） and palmitic acid （C?16∶0）.The total content of unsaturated fatty acid reached 36.2%，which also accorded with the characteristics of non-pathogenic strain of potato scab.Then the key gene of fatty acid synthesis，coding 3-ketoacyl ACP synthase III （FabH），was amplified and analyzed from the C9 strain genome.The results showed that the fabH gene sequence and the coded amino acid sequence were highly consistent with those of Streptomyces scabies.[Conclusion]The C9 strain was a new strain of Streptomyces scabies.The C9 strain provided a good material for further study on the basic metabolic mechanism of Streptomyces scab and its pathogenic mechanism.

Key wordsStreptomyces scabies;16S rDNA;Fatty acids composition

馬鈴薯是世界上除水稻、小麥和玉米外的第四大糧食作物，在蔬菜、飼料及工業(yè)原料領(lǐng)域均具有重要的經(jīng)濟價值[1]。但隨著種植面積擴大，馬鈴薯相關(guān)的微生物病害逐漸凸顯，其中馬鈴薯瘡痂病（potato common scab）是一類重要的土傳病害，嚴重影響馬鈴薯塊莖的外觀品質(zhì)，造成嚴重的損失[2]。

馬鈴薯瘡痂病病原菌為鏈霉菌屬（Strptomyces spp.），國內(nèi)外報道的主要有S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies，3種菌株生理生化特征差異明顯[2-5]。隨著研究深入，越來越多的鏈霉菌病原菌被發(fā)現(xiàn)，表明馬鈴薯瘡痂病菌種類多，分布和組成復(fù)雜。對我國不同地區(qū)的瘡痂病原菌分析表明，在分離到的病原菌中除常見的致病菌株外，還發(fā)現(xiàn)S.bobili、S.galilaeus、S.enissocaesilis等新的馬鈴薯瘡痂病菌[6]。黑龍江省不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌有3種，其中S.scabies為主要病原菌，而且不同病原菌的致病力有明顯差異[7]。因此我國瘡痂病病原菌種類及組成具有明顯的多樣性，不同地區(qū)或同一地區(qū)不同季節(jié)流行不同的病原鏈霉菌，明確特定地區(qū)的病原菌組成對了解及防治馬鈴薯瘡痂病十分必要，但目前未見對廣東地區(qū)該病原鏈霉菌的研究[5]。筆者通過對土壤中分離到的鏈霉菌進行分析，鑒定其中的C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌新變種，并分析了該菌株的生理生化?特性。

1材料與方法

1.1病原菌的分離

從廣東省廣州周邊馬鈴薯種植地塊采集土壤，取10 g樣品于90 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩。靜置后去上清液進行10倍系列稀釋，選10-2、10-2、10-4 3個稀釋度，分別取0.1 mL涂布于改良高氏1號平板，30 ℃倒置培養(yǎng)5 d，挑選菌落形態(tài)不同的菌株劃線純化，重復(fù)3次。

1.2致病性測定

選擇健康馬鈴薯種薯經(jīng)75%乙醇溶液浸泡10 min進行表面消毒，無菌操作切取含有芽眼的薯塊，播入裝有滅菌土的花盆中，每盆3塊。栽種60 d后，用待測菌株孢子稀釋液接種至花盆土壤，置于室溫中繼續(xù)培養(yǎng)30 d后檢測新生薯塊的發(fā)病情況[8]。

1.3生理生化特性測定

參照《伯杰細菌鑒定手冊》[9]和《鏈霉菌鑒定手冊》[10]中測定方法，對該菌株進行碳源利用、氮源利用、纖維素利用、淀粉利用和蛋白酶產(chǎn)生能力等分析，并進一步利用Biolog微孔板對多種生理生化特性及敏感性等進行測定。

1.416S rDNA序列分析與致病相關(guān)基因分析

病原菌總DNA采用細菌基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司）的方法提取。PCR擴增用引物見表1，擴增條件：① 98 ℃預(yù)變性2 min;② 98 ℃變性20 s;③ 56 ℃退火20 s;?④ 72 ℃延伸20 s;⑤ 重復(fù)②～④35個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，16S rDNA擴增片段送上海生工公司測序，將得到的序列進行Blast比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5細胞脂肪酸組成分析

在合成V號培養(yǎng)基中，培養(yǎng)馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌，離心收集菌體，按照文獻[11-12]的方法，提取細菌的脂肪酸，并轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯（樣品3個重復(fù)）。樣品送華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測試中心進行脂肪酸組成GC-MS?分析。

2結(jié)果與分析

2.1C9菌株形態(tài)與16S rDNA序列分析

從馬鈴薯栽種土壤中采樣，稀釋后涂布于高氏1號培養(yǎng)基，培養(yǎng)后獲得多種單菌落。其中C9菌株菌絲為絲狀，革蘭氏染色陽性（圖1 a），培養(yǎng)后期生成灰色孢子，孢子鏈成螺旋狀（圖1 b）。

為確定C9菌株種屬歸類，利用細菌16S rDNA通用引物，以C9菌株的總DNA為模板，擴增獲得約1.5 kb的16S rDNA序列（圖2 a），連接T-載體后獲得質(zhì)粒pYYH-1，并送樣測序獲得16S rDNA全序列。進一步將測序結(jié)果在NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫Blast分析，結(jié)果顯示該序列與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌同源性最高。選取與比對序列相似性大于95%的菌株和已經(jīng)報道的馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌菌株16S rDNA序列，利用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化分析（NJ法）（圖2 b）。結(jié)果顯示C9菌株與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyce scabiei）標準菌株ATCC49173的親緣關(guān)系最近，相似性為?99.7%。這表明C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyce scabiei）菌株。

2.2C9菌株生理生化特性分析

進一步分析C9菌株的生理生化特征，結(jié)果顯示，C9菌株能以葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、肌酐、肌醇等作為唯一碳源生長，但不能利用果糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘油等為單一碳源生長。C9菌株能以脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸等為唯一氮源生長，但不能以組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等為唯一氮源。C9菌株對青霉素、四環(huán)素、林肯霉素、萬古霉素等抗生素以及結(jié)晶紫、四唑紫、鹽酸胍等化合物敏感，同時該菌株在含有10%NaCl培養(yǎng)基中不能生長，pH<5.5不能生長。C9菌株產(chǎn)生黑色素和H2S氣體，不產(chǎn)生可溶性色素，產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，但不產(chǎn)生蛋白酶。綜合分析以上生理生化特性，顯示C9菌株與已報道的典型馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌有明顯差異，說明該菌株為新的菌株[2，13-14]。

2.3C9菌株的致病性分析

為分析C9菌株是否對馬鈴薯具有致病性，采用致病性盆栽試驗，在馬鈴薯種植30 d后觀察新生薯塊發(fā)病情況。結(jié)果顯示，C9菌株不能對盆栽馬鈴薯致病，未出現(xiàn)瘡痂癥狀（圖3）。

馬鈴薯瘡痂病病原菌多種多樣，寄主范圍也較廣，但致病因子均存在于染色體上的致病島（PAI）區(qū)域。當前報道的PAI區(qū)域基因主要包括txtA基因、txtB基因、txtC基因、壞死誘導(dǎo)蛋白nec1基因和致病因子tomA基因等[15-17]。為研究C9菌株不能使盆栽馬鈴薯出現(xiàn)瘡痂癥狀的原因，分別擴增了該菌株基因組上這幾個致病相關(guān)的基因，但結(jié)果均未擴增到目的基因，說明C9菌株可能沒有相關(guān)的致病因子或致病島PAI，這極可能是該菌株不能引物馬鈴薯致病的重要?原因。

2.4C9菌株的脂肪酸組成分析

細菌采用II型脂肪酸合成機制合成脂肪酸，每步反應(yīng)都由特定的酶催化完成。而脂肪酸是細菌細胞膜的重要組成物質(zhì)，具有靈敏度高、成分高度保守和含量穩(wěn)定等特點[18]。目前在細菌中已發(fā)現(xiàn)300多種脂肪酸，其碳鏈長度、雙鍵位置和功能團組合的不同使其成為有效的分類標記，而脂肪酸組成和含量與微生物的遺傳變異、耐藥性、致病性等有極為密切的關(guān)系[19]。研究表明，鏈霉菌的脂肪酸組成可以作為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌是否為致病菌的重要評價指標[20]。

為此，測定了C9菌株的脂肪酸組成。結(jié)果顯示，C9菌株的脂肪酸組成較為復(fù)雜，檢測到約20種不同結(jié)構(gòu)的脂肪酸，包括直鏈飽和脂肪酸、支鏈飽和脂肪酸、直鏈不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸等，檢測到的脂肪酸鏈長包括12碳到18碳。不同脂肪酸組分含量不同，其中含量最高的棕櫚油酸（C?16：1）占總脂肪酸組分的28.4%，其次是棕櫚酸（C?16：0）占?18.0%。細菌的支鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸在調(diào)節(jié)膜的流動性方面發(fā)揮重要作用，C9菌株產(chǎn)生支鏈脂肪酸包括12-甲基十三烷酸（isoC?14：0）、13-甲基十四烷酸（isoC?15：0）和12-甲基十四烷酸（anteisoC?15：0）等，支鏈脂肪酸總含量占比33.6%。不飽和脂肪酸包括棕櫚油酸、順-11-異油酸等，總含量占比36.2%（圖4）。

2.5C9菌株的3-酮脂酰ACP合成酶III的同源性分?析

脂肪酸合成是細菌的基礎(chǔ)代謝，脂肪酸合成相關(guān)的基因簇往往具有一定的保守性。3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）催化脂肪酸合成的起始反應(yīng)，其編碼基因是細菌生長的必需基因[21]。為進一步研究C9菌株的種屬歸類，以表1中的fabH up和fabH down引物，以C9菌株的總DNA為模板，擴增獲得該菌株的fabH基因。測序結(jié)果顯示，C9菌株的fabH基因與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）的fabH基因序列一致性為98.8%，其編碼蛋白的氨基酸序列一致性達99.7%。這再次證明該研究分離獲得的C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌。

3結(jié)論與討論

該研究對從土壤中分離到的一株鏈霉菌C9菌株進行了分析。首先分析了該菌株的16S rDNA序列，結(jié)果顯示C9菌株與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabiei）的16S rDNA序列高度同源，結(jié)合菌落形態(tài)特征，初步確定該菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌。

但進一步生理生化分析顯示C9菌株與文獻報道的馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌多種菌株都不完全一致[13-14]，提示該菌株可能是一個新菌株。采用盆栽法檢測C9菌株對馬鈴薯的致病性，結(jié)果顯示該菌株沒有致病性，致病性相關(guān)的PAI基因檢測結(jié)果也顯示陰性，進一步說明該菌株不同于文獻報道的馬鈴薯瘡痂病的致病菌株。

由于脂肪酸組成可以作為微生物分類鑒定的重要指標，測定了C9菌株的脂肪酸組成。結(jié)果顯示，與報道的鏈霉菌相比，該菌株的支鏈脂肪酸相對較低，不飽和脂肪酸含量相對較高，其特點符合Kinkel等[20]報道的馬鈴薯瘡痂病非致病菌。該結(jié)果與盆栽致病性檢測結(jié)果相吻合，也表明C9菌株為一個非致病性菌株。基于細菌脂肪酸合成途徑的保守性，進一步擴展了C9菌株的脂肪酸合成關(guān)鍵基因——3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH），結(jié)果顯示該基因序列與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabiei）的fabH序列具有高度一致性，而兩者編碼的氨基酸序列也幾乎一致，再次證明C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌，但該菌株沒有致病性，為非致病性變種。該研究發(fā)現(xiàn)的C9菌株可作為研究材料，用于馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌的基礎(chǔ)代謝研究，同時還可通過比較致病株和非致病株的基因組信息研究，探索馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌致病的分子機制。

參考文獻

[1]黃鳳玲，張琳，李先德，等.中國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策[J].農(nóng)業(yè)展望，2017，13（1）：25-31.

[2]趙偉全，楊文香，李亞寧，等.中國馬鈴薯瘡痂病菌的鑒定[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，39（2）：313-318.

[3]張萌，劉伯，于秀梅，等.中國馬鈴薯瘡痂病菌生物學(xué)特性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（12）：2603-2610.

[4]信凈凈，于秀梅，趙偉全，等.馬鈴薯瘡痂病新致病種Streptomyces galilaeus致病毒素組分分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（18）：3742-3749.

[5]張萌，趙偉全，于秀梅，等.中國馬鈴薯瘡痂病病原菌16S rDNA的遺傳多樣性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（2）：499-504.

[6]楊夢平，王瑞仙，杜魏甫，等.云南省馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌種類組成研究[J].植物病理學(xué)報，2018，48（4）：445-454.

[7]邢瑩瑩，呂典秋，魏琪，等.黑龍江省部分地區(qū)馬鈴薯瘡痂病菌種類及致病性鑒定[J].植物保護，2016，42（1）：26-32，50.

[8]張海穎，郭鳳柳，許華民，等.河北省張北地區(qū)馬鈴薯瘡痂病的病菌鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：131-134.

[9]中國科學(xué)院微生物所放線菌分類組.鏈霉菌鑒定手冊[M]. 北京：科學(xué)出版社，1978.

[10]阮繼生， 黃英. 中國科學(xué)院微生物所放線菌分類組編. 放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類[M].北京：科學(xué)出版社，2011.

[11]YU Y H，HU Z，DONG H J，et al.Xanthomonas campestris FabH is required for branched-chain fatty acid and DSF-family quorum sensing signal biosynthesis[J].Sci Rep，2016，6：1-15.

[12]ZHU L，BI H K，MA J C，et al.The two functional enoyl-acyl carrier protein reductases of Enterococcus faecalis do not mediate triclosan resistance[J].mBio，2013，4（5）：1-10.

[13]張建平，劉佳，哈斯，等.馬鈴薯瘡痂病菌（Streptomyces spp.）的鑒定[J].中國馬鈴薯，2018，32（5）：308-314.

[14]王丹，姚曉東，李新鳳，等.山西晉城馬鈴薯瘡痂病病原菌鑒定[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2015，35（5）：495-498.

[15]聶峰杰，陳虞超，鞏檑，等.馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌分類及其致病機理研究進展[J].分子植物育種，2018，16（4）：1313-1319.

[16]李爽，楊美軍，張云，等.馬鈴薯瘡痂病研究進展[J].中國馬鈴薯，2018，32（4）：240-248.

[17]趙偉全，劉大群，楊文香，等.馬鈴薯瘡痂病菌致病相關(guān)基因的克隆及表達[J].植物病理學(xué)報，2007，37（4）：442-445.

[18]余永紅，馬建榮，王海洪.細菌脂肪酸合成多樣性的研究進展[J].微生物學(xué)雜志，2016，36（4）：76-83.

[19]劉國紅，劉波，唐建陽，等.脂肪酸提取方法對芽胞桿菌種類脂肪酸測定結(jié)果的影響[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，30（1）：60-64.

[20]KINKEL L L，BOWERS J H，SHIMIZU K，et al.Quantitative relationships among thaxtomin A production，potato scab severity，and fatty acid composition in Streptomyces[J].Canadian journal of microbiology，1998，44（8）：768-776.

[21]余永紅，馬建榮，苗馨予，等.不同細菌來源的3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ生物學(xué)特性分析[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2016（10）：1004-1012.