枯草芽孢桿菌Yz菌株發酵原粉丸化種衣劑與化學藥劑復配劑的研制

羅振亞 林開春 徐淑

摘要[目的]篩選可與枯草芽孢桿菌Yz菌株聯用的化學藥劑及復配比例，以提高枯草芽孢桿菌Yz菌株對棉花立枯病的防治效果。[方法]采用稀釋平板計數法，測定Yz菌株發酵原粉中活菌數，比較不同化學藥劑與Yz菌的生物相容性;采用盆栽試驗，測定復配種衣劑對棉花立枯病的防效以及對棉花種子發芽率的影響。[結果]甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈對Yz菌芽孢活性具有保護作用，活芽孢下降率分別為39.70%、39.99%、46.33%、50.42%，顯著低于對照;多抗霉素和代森錳鋅對Yz菌芽孢活性無影響，活芽孢下降率與對照無顯著差異;可用來與Yz丸化種衣劑進行復配。盆栽試驗表明，Yz丸化種衣劑與代森錳鋅、多菌靈、甲基托布津復配后，棉花種子發芽率較高，為85.00%～94.98%，對棉花立枯病的防效也提高，為63.99%～71.37%。其中，甲基托布津以0.3%和0.5%的比例與Yz丸化種衣劑混配效果最好，防效分別為74.42%、76.58%。[結論]甲基托布津與Yz丸化種衣劑復配效果較好，以0.3%比例復配最佳。

關鍵詞枯草芽孢桿菌;棉花立枯病;丸化種衣劑;復配;化學藥劑

中圖分類號S?435.621文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0143-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Development of Compound Agents for Seed Pelleting Agent of the Fermentation Powder of Bacillus subtilis Yz Strain and Pesticide

LUO Zhen-ya1，LIN Kai-chun2，XU Shu1 （1.Plant Protection Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection，Guangzhou，Guangdong 510640;2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan，Hubei 430070）

Abstract[Objective]To improve the control effect of the fermentation powder of Bacillus subtilis Yz strain on cotton damping-off by screening out pesticide and ratio combined with bacillus subtilis Yz strain.[Method]The number of viable bacteria in fermentation powder of Yz strain was determined by dilution plate counting method to determine the biocompatibility of pesticide and Yz.Pot experiments was conducted to determine the effect of compound seed coating agent on cotton damping-off and germination rate of cotton seeds.[Result]?The include thiophanate-methyl，iprodione，chlorothalonil，carbendazim had protective effects on the spore activity of Yz bacteria，and the reduction rate of live spore was 39.70%，39.99%，46.33% and 50.42%，respectively，which was significantly lower than that of the control group.Polyoxin and mancozeb had no effect on the spore activity of Yz bacteria，and the reduction rate of live spore was not significantly different from that of the control group.The pesticides stated above can be used to compound with Yz seed coating agent.Pot experiments showed that when pelleting seed-coating agent of Yz was compound with mancozeb，carbendazim，thiophanate-methyl，the cotton had higher germination rate （85.00% to 94.98%） and lower incidence of cotton damping-off （the control effect was 63.99% to 71.37%）.In addition，the mixtures of thiophanate-methyl and Yz pelleting seed-coating agent with the ratio of 0.3% and 0.5% had the best control effect，which was 74.42% and 76.58%，respectively.[Conclusion]The mixture of thiophanate-methyl and Yz pelleting seed-coating agent had the most obvious effect，and the best compound proportion was 0.3%.

Key wordsBacillus subtilis;Cotton damping-off;Pill seed coating agent;Compound;Pesticide

棉花立枯病又稱爛根、黑根病，主要由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染引起[1-2]，以種子和土壤為傳播媒介，在棉花幼苗期發生普遍，可造成大量爛種、爛根和弱苗以及棉花生長發育遲緩，甚至嚴重影響棉花的產量和品質[3-4]。防治棉花立枯病的方法主要有藥劑浸種、藥劑拌種、苗期噴藥、溫湯浸種、深耕冬灌、輪作等[5]，其中藥劑拌種是目前最常用的方法。種衣劑具有保護種子、提高出苗率、防治病蟲害、促進作物生長、增強抗逆性等作用[6-9]，并可以減少農藥的使用，降低病原菌和害蟲產生抗藥性的風險[10]。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是防治植物病害的一種有效生防菌，抑菌范圍較廣泛[11-12]，其突出特征為生長速度快、營養簡單、耐熱抗逆性強且有利于生防菌的加工生產[13-14]。國外已有多個菌株獲得商品化生產許可，如GBO3、MBI600、QST713[15]和解淀粉枯草芽孢桿菌變種FZB24[16]，我國成功開發的制劑有百抗、麥豐寧、紋曲寧、萎菌凈、亞寶等[17-18]。

生防菌雖低毒、綠色環保，但易受環境、氣候、定殖能力等的影響，存在大田防效差、顯效慢等特點。目前，生物與化學相結合的病蟲害防治策略既能有效控制病蟲害，又能降低化學農藥使用量，受到各國植物保護專家的重視[19]。在前期研究工作中，已從土壤中分離篩選到一株對棉花苗期病害有抑制活性的枯草芽孢桿菌Yz菌株，并研制出其丸化種衣劑配方，經盆栽試驗證明其對棉花立枯病具有較好的防病作用。因此，筆者篩選可與枯草芽孢桿菌Yz菌株聯用的化學藥劑并進行復配，以期為生防制劑的開發提供技術支持，為棉花立枯病的可持續防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試棉花品種。鄂棉23號（裸種），由武漢市農業科學院提供;鄂棉23號（10%拌種靈和福美雙懸浮種衣劑包衣），市售。

1.1.2病原指示菌以及活性菌株。

供試菌株：棉花立枯病原菌（Rhizoctonia solani kuhn），由武漢天惠生物工程有限公司提供。枯草芽孢桿菌Yz菌劑發酵原粉（Bacillus subtilis），由武漢天惠生物工程有限公司提供。

1.1.3供試藥劑。

枯草芽孢桿菌Yz菌株發酵原粉丸化種衣劑配方（以下簡稱Yz丸化種衣劑）：硅藻土：羧甲基纖維素鈉：木質素磺酸鈉：Yz=6 g：1.6 g：0.2 g：2 g。化學藥劑：50%多菌靈超微可濕性粉劑（山西臨汾有機化工廠）、70%代森錳鋅可濕性粉劑（美國巨邦農資國際貿易公司）、75%百菌清可濕性粉劑（利民化工有限責任公司）、15%三唑酮可濕性粉劑（四川化學工業研究設計院）、50%撲海因可濕性粉劑（安萬特作物科學公司）、97%甲基托布津原藥（山東華陽科技股份有限公司）、1.5%多抗霉素可濕性粉劑（吉林延邊春蕾生物藥業有限公司）。

1.2試驗方法

1.2.1化學殺菌劑的篩選。

將待篩選的化學殺菌劑與Yz原粉按1∶1（W/W）的比例混合均勻，密封儲藏于（54±2）℃恒溫箱中14 d，以未處理的Yz原粉為對照，無菌水為空白對照，采用稀釋平板計數法測定其菌數，通過測定菌數的下降率來判斷化學殺菌劑對Yz原粉生物活性的影響。選出對Yz原粉活性影響較小甚至有保護作用的化學殺菌劑，進一步通過棉花盆栽試驗篩選出與Yz原粉復配效果最好的化學藥劑和最佳用量。

1.2.2棉花盆栽試驗。

棉種經過硫酸脫絨后加稀堿溶液水洗至pH 7左右后，精選飽滿的種子。將化學藥劑與枯草芽孢桿菌Yz菌株發酵原粉丸化種衣劑復配，然后進行棉花種子包衣處理。化學藥劑的量設置3個比例，分別為包衣種子重量的0.1%、0.3%、0.5%。棉花種子包衣后播于接入棉花立枯病菌的無菌沙（一根試管斜面病菌菌種接500 g無菌沙）中。無菌沙以塑料小碗分裝，每碗裝土300 g，每碗播15粒種子，放置于華中農業大學農藥研究室網室中。每處理4次重復。并分別設接種棉花立枯病（病CK）和不接種棉花立枯病（空CK）的空白對照以及鄂棉23號（市售）處理，出苗后5～?7 d調查出苗率和棉苗發病情況。

發芽率 =（出苗株數/種子總數）×100%

病情指數=（各級病株數×各級代表值）/（調查總株?數×9）×100

防治效果=[（空白對照區病情指數-處理區病情指數）/空白對照區病情指數]×100%

立枯病病情分級標準：0級，全株無病;1級，根部病斑占整個根部面積的10%以下;3級，根部病斑占整個根部面積的11%～25%;5級，根部病斑占整個根部面積的26%～50%;7級，根部病斑占整個根部面積的51%～75%;9級，根部病斑占整個根部面積的76%以上。

1.3數據分析采用Microsoft Excel（2007版）軟件對試驗數據進行分析和繪圖，平均數采用Duncan法進行多重比較，顯著水平P=0.05。

2結果與分析

2.1化學藥劑對Yz原粉活芽孢的影響

由圖1可知，經?54 ℃恒溫處理14 d后，未添加化學藥劑的Yz原粉活芽孢下降率為68.47%。添加化學藥劑甲基托布津、多菌靈、代森錳鋅、撲海因、百菌清、多抗霉素、三唑酮后，Yz原粉活芽孢下降率分別為39.70%、50.42%、68.11%、39.99%、46.33%、61.80%、78.43%。添加甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈的Yz原粉活芽孢下降率顯著低于空白對照（P>0.05）;添加多抗霉素和代森錳鋅的Yz原粉活芽孢下降率與空白對照相當，無顯著差異（P<0.05）;添加三唑酮的Yz原粉活芽孢下降率顯著高于空白對照（P>0.05）。

2.2Yz丸化種衣劑與化學藥劑復配劑對棉花種子發芽率及棉花立枯病防治效果的影響

2.2.1棉花種子發芽率。

將50%多菌靈、70%代森錳鋅、甲基托布津原藥、75%百菌清、1.5%多抗霉素、50%撲海因6種化學藥劑分別按一定比例混入Yz丸化種衣劑配方中（各化學藥劑的量均為包衣種子重量的0.3%）。結果表明（表1），甲基托布津、多菌靈、代森錳鋅、撲海因、百菌清、多抗霉素6種藥劑與Yz丸化種衣劑混配后，棉花種子發芽率分別為?88.30%、94.98%、85.00%、?71.68%、81.68%、70.00%。多菌靈+Yz處理的棉花種子發芽率顯著高于其他幾個藥劑處理，甲基托布津+Yz、代森錳鋅處理次之，撲海因+Yz和多抗霉素+Yz處理的棉花種子發芽率顯著低于其他處理。

2.2.2棉花立枯病防治效果。

由表1可知，甲基托布津、多菌靈、代森錳鋅、撲海因、百菌清、多抗霉素6種藥劑與Yz丸化種衣劑混配后，對棉花立枯病的防治效果分別為?71.37%、66.52%、63.99%、?46.01%、30.45%、28.42%。甲基托布津+Yz處理對棉花立枯病的防效最高，但與市售的鄂棉23號和多菌靈+Yz處理的防效均相當，無顯著差異;撲海因+Yz與Yz處理對棉花立枯病的防效相當，而百菌清+Yz和多抗霉素+Yz處理對棉花立枯病的防效相對較差，顯著低于其他處理。

2.3Yz丸化種衣劑復配化學藥劑的篩選與優化

根據以上試驗結果，選擇甲基托布津、多菌靈和代森錳鋅與Yz丸化種衣劑進行復配。3種藥劑與Yz丸化種衣劑復配的用量見表2。結果表明，3種藥劑不同劑量與Yz丸化種衣劑復配后，棉花種子發芽率可達83.33%～93.35%，與對照無顯著差異。多菌靈含量為?0.1%、0.3%和0.5% 3個處理對棉花立枯病的防治效果分別為66.17%、71.80%、72.69%;代森錳鋅含量為?0.1%、0.3%和0.5%3個處理對棉花立枯病的防治效果分別為53.82%、68.37%、68.28%;甲基托布津含量為0.1%、0.3%和?0.5%3個處理對棉花立枯病的防治效果分別為?57.02%、?74.42%、76.58%。甲基托布津含量為?0.3%和0.5%的處理對棉花立枯病的防效較高，其次為多菌靈含量為0.3%和0.5%的處理，接著為代森錳鋅含量為0.3%和0.5%的處理以及多菌靈含量為0.1%的處理，而代森錳鋅含量為0.1%、甲基托布津含量為0.1%處理的防效則較差（表3）。

綜合以上結果，甲基托布津原藥（0.3%和0.5%）與Yz丸化種衣劑的混配效果最佳，從環保和防效綜合因素考慮選擇甲基托布津原藥0.3%的處理。最終配方為硅藻土：羧甲基纖維素鈉∶木質素磺酸鈉∶Yz∶甲基托布津原藥=6 g∶1.6 g∶?0.2 g∶2 g∶0.092 g。

3結論與討論

生防微生物和化學藥劑協同防治植物病害是進行安全無害化、環境友好型防治的重要舉措[20]。通過該舉措，可達到防效提高、化學藥劑用量減少、優勢互補等效果。廣東省植物保護新技術重點實驗室自主研制的枯草芽孢桿菌Yz菌株丸化種衣劑對盆栽苗棉花立枯病具有較好的防效，但在田間其防效則較不穩定。該研究篩選了幾種可與Yz菌株丸化種衣劑聯用的化學藥劑，并進行復配。結果表明，甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈對Yz菌株原粉芽孢活性具有保護作用，多抗霉素和代森錳鋅對Yz原粉芽孢活性無影響，而三唑酮對Yz原粉芽孢活性則有明顯的抑制作用。因此，甲基托布津、撲海因、百菌清、多菌靈、多抗霉素和代森錳鋅與Yz菌的相容性較好，可用來與Yz丸化種衣劑進行復配。盆栽試驗結果表明，撲海因、百菌清和多抗霉素添加到Yz丸化種衣劑后，棉苗的發芽率相對較低，而棉花立枯病的發病率則相對較高。因此最終選擇甲基托布津、多菌靈和代森錳鋅與Yz丸化種衣劑進行復配。

化學藥劑有助于生防微生物能夠順利地在各種土壤生態環境中定殖、繁殖，并形成優勢種群，從而更好地發揮生物防治作用[21-24]。該研究結果表明，將甲基托布津、多菌靈和代森錳鋅與Yz丸化種衣劑進行復配后，棉花種子發芽率為85.00%～94.98%，與對照無顯著差異;復配劑對棉花立枯病的抑制有明顯的增效作用，其中甲基托布津按0.3%和0.5%的比例與Yz丸化種衣劑復配時增效作用最明顯，防效分別為74.42%、76.58%，顯著高于對照，可選用甲基托布津與Yz菌株丸化種衣劑按0.3：100的比例復配進一步進行田間防病試驗，確定防治效果。

生防菌和化學藥劑協同防治綜合了生防菌和化學殺菌劑的優點，可彌補生防菌抑菌效果慢、田間防效不穩定的缺點，從而為菌劑更好的開發利用提供指導作用[25]。該研究也證實了這一點，但關于枯草芽孢桿菌Yz菌株與化學藥劑甲基托布津的協同增效作用機制，枯草芽孢桿菌Yz菌株在棉苗中的殘留消解動態，質保期及使用規范還有待于進一步研究。

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