QuEChERS-液質聯用法同時測定農產品中3種農藥及其代謝物殘留

孫明娜 余璐 王雯雯 王梅 董旭 童舟 褚玥 楊通 高同春 段勁生

摘要[目的]建立同時檢測農產品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-MS/MS）方法。[方法]樣品用乙腈提取，經C?18凈化，采用UPLC-MS/MS檢測，基質匹配外標法進行定量。[結果]在5種基質（糙米、面粉、玉米、白菜、蘋果）中，農藥及代謝物在0.005～0.500 mg/L線性關系良好，相關系數大于0.996，定量限均小于10 μg/kg。在0.01、?0.10和1.00 mg/kg添加水平下，平均回收率為71.2%～105.0%，相對標準偏差（RSD）為1.28%～16.70%。[結論]該方法靈敏度、準確度和精密度均滿足農藥殘留分析的要求，可用于農產品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留的同時檢測。

關鍵詞QuEChERS;UPLC-MS/MS;農藥殘留;農產品;代謝物

中圖分類號TQ?450.2文獻標識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0211-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.059

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Simultaneous Determination of Three Pesticides and Their Metabolite Residues in Agricultural Products by-Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SUN Ming-na1，YU Lu1，WANG Wen-wen2 et al（1.Institute of Plant Protection and Agricultural Product Quality Safety，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Agricultural Product Quality and Safety Risk Assessment Laboratory of Ministry of Agriculture and Rural Agriculture （Hefei），Hefei，Anhui 230031;2.Anhui Jianghuai Horticultural Seed Co.，Ltd.，Hefei，Anhui 230000）

Abstract[Objective]The research aimed to establish a method of simultaneous detection of phorate，prothioconazole and fipronil and its metabolite residues in agricultural products by QuEChERS-UPLC-MS/MS.[Method]The samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up by C?18，determined by UPLC-MS/MS and quantified by the matrix-matched external standard method.[Result]The calibration curves were linear in the range of 0.005-0.500 mg/L with the correlation coefficients larger than 0.996，the limits of quantitation were less than 10 μg/kg in five different matrix （brown rice，wheat flour，maize，Chinese cabbage，apple）.The mean recovery of 9 pesticides were 71.2%-105.0% and the relative standard deviation （RSD） was 1.28%-16.70% at 0.01，0.10 and 1.00 mg/kg with hree spiked levels.[Conclusion]The sensitivity，accuracy and precision of the method meet the requirements of pesticide residue analysis，and can be used for simultaneous detection of phorate，prothioconazole and fipronil and their metabolite residues in agricultural products.

Key wordsQuEChERS; UPLC-MS/MS; Pesticide residues;Agricultural products;Metabolites

甲拌磷是高毒廣譜內吸性殺蟲劑，主要用于防治地下害蟲、蚜蟲等。甲拌磷在自然條件下經過氧化反應產生毒性更大的2種代謝物甲拌磷砜和甲拌磷亞砜。甲拌磷砜和甲拌磷亞砜在環境中比較穩定，其殘留期比甲拌磷長[1]。丙硫菌唑是新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑，廣泛應用于谷類、麥類、豆類農產品中，對麥類病害有很好的防效，其在作物中的主要代謝物是其脫硫產物硫酮菌唑[2]。氟蟲腈是苯基吡唑類殺蟲劑，可用于防除鱗翅目和直翅目害蟲以及地下鞘翅目害蟲的幼蟲。在氟蟲腈施用于作物的過程中，主要代謝產物有氟蟲腈硫醚（MB 45950）、氟蟲腈砜（MB 46136）、氟甲腈 （MB 46513），都有一定毒性，有的甚至高于母體[3]。國家標準GB 2763—2016《食品安全國家標準 食品中最大農藥殘留限量》中規定了甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈在食品中的最大殘留限量，并且殘留量均包括農藥母體和其代謝物之和。然而，標準中推薦的檢測方法并不完全覆蓋農藥母體及其代謝物，如檢測甲拌磷的標準方法GB/T5009.20—2003只檢測甲拌磷，不檢測甲拌磷砜和甲拌磷亞砜;檢測氟蟲腈的標準方法SN/T 1982—2007和NY/T 1379—2007都僅僅檢測氟蟲腈不包括其代謝物。丙硫菌唑暫無國標檢測方法。由于甲拌磷、丙硫菌唑、氟蟲腈及代謝物殘留能同時檢測的方法缺失，造成農產品中檢測方法標準和殘留判定標準的不一致。另一方面，上述3種農藥及其代謝物需要在不同方法的不同儀器中檢測，方法繁瑣，檢測效率低。因此，建立快速準確的農產品中甲拌磷、丙硫菌唑、氟蟲腈及其代謝物的測定方法尤為重要。

目前國內外有關檢測甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈的主要方法有液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6-8]、氣相色譜質譜法[9-10]、氣相色譜串聯質譜法[11]、液相色譜串聯質譜法[12-15]。甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈殘留量檢測方法的研究雖然報道較多，但多以水果、蔬菜中的測定方法為主。目前有關農產品中同時檢測甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物的快速測定方法鮮見報道。QuEChERS 是一種快速、簡單、高效、廉價的樣品前處理方法，已廣泛應用于水果、蔬菜、谷物等低脂肪類基質中農藥殘留的測定[16-18]。筆者建立基于QuEChERS方法的超高效液相色譜-串聯質譜同時測定農產品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留量的方法，以期為農產品中農藥殘留的檢測工作提供技術支撐。

1材料與方法

1.1供試藥劑3種農藥及其代謝物（以下簡稱9種化合物）標準品均購于美國Achemtek公司;C?18吸附劑購于天津博納艾杰爾科技有限公司;氯化鈉為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司;甲醇、乙腈為色譜純，購于美國TEDIA公司;乙酸銨、甲酸為色譜純，購于美國aladdin公司。

1.2儀器ACQUITY 超高效液相色譜-Xevo TQ-S 三重四級桿質譜儀（美國Waters公司）;渦旋混合器（德國IKA公司）;ZB-85氣浴恒溫振蕩器（江蘇金壇市中大儀器廠）;HC-3018高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）。

1.3前處理方法

稱取5.0 g勻漿樣品于50 mL具塞離心管中，加入5 mL水、10 mL乙腈，振蕩1 h，再加入3 g 氯化鈉，渦旋1 min，以4 500 r/min離心5 min。取2 mL上層提取液于含有50 mg C?18和150 mg無水硫酸鎂的10 mL離心管中，渦旋1 min，以7 000 r/min離心5 min，取上清液過 ?0.22 μm 微孔膜過濾供UPLC-MS/MS分析。

1.4儀器條件

1.4.1液相色譜條件。色譜柱為 Waters CORTECS UPLC C?18（粒徑1.7 μm，2.1 mm×50 mm）;流動相A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液;B為甲醇;流速0.25 mL/min;進樣體積5 μL;柱溫40 ℃;洗脫方式為梯度洗脫，洗脫程序如下：0～?1 min，5% B相～40% B相;1～3 min，40% B ～80% B相;3～?5 min，80% B相～5% B相;5～6 min，5% B相。

1.4.2質譜條件。毛細管電壓為0.5 kV;離子源溫度?150 ℃;去溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣，去溶劑氣流速為?1 000 L/h;錐孔電壓4 V;碰撞氣為高純氬氣。3種農藥及其代謝物的質譜參數見表1。

1.5標準儲備溶液的配制

1.5.1農藥單標溶液的配制。準確稱取各農藥標準品10 mg（精確至0.01 mg）分別置于10 mL的容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，分別配成1 000 mg/L的標準母液，于4?℃避光保存。

1.5.2混合標準溶液的配制。根據單標濃度，準確量取適量單標溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，于4?℃避光保存。

1.6標準曲線的繪制分別用乙腈、糙米空白基質溶液、面粉空白基質溶液、玉米空白基質溶液、白菜空白基質溶液和蘋果空白基質溶液稀釋，配制成0.001、0.005、0.010、0.050、?0.100和0.500 mg/L系列標準溶液，按“1.4”條件測定。以溶液質量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制工作曲線，外標法定量。

1.7添加回收試驗

分別在空白樣品中添加適量的混合標準溶液，添加水平為0.01、0.10和1.00 mg/kg，每個水平重復5次。按“1.3”和“1.4”的步驟進行樣品前處理和分析測定，并設空白對照。計算回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.8基質效應評估方法基質效應（ME）按以下公式進行計算：

ME=（基質匹配標準曲線斜率純溶劑標準曲線斜率-1）×100%

|ME|<20%為弱基質效應，可忽略而無需采取補償措施;20%≤|ME|≤50%為中等程度基質效應，?|ME|>50%為強基質效應，須采取措施補償基質效應。

2結果與分析

2.1色譜條件的優化

比較甲醇-水、乙腈-水及在水相中添加不同體積分數的調節劑甲酸（0.02%、0.05%和0.1%）、乙酸銨（2、 5和10 mmol/L）對9種化合物的分離度、靈敏度和峰型的影響，結果表明，在流動相中加入微量的甲酸和乙酸銨均可改善峰型，有效提高目標化合物的響應值。目標化合物的響應值隨著甲酸的濃度增大而增大。而當乙酸銨的濃度由5 mmol/L提高至10 mmol/L時，其響應值并未明顯增加。將有機相甲醇換成乙腈后，發現目標峰的響應值降低。因此，經優化后最終采用5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動相。

2.2質譜條件的優化

以5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇為流動相，在正負離子模式下，對9種化合物的標準溶液（0.1 mg/L）分別進行全掃描，結果發現， 9種目標化合物均獲得穩定的母離子。然后進行子離子掃描，優化碰撞能，每種化合物選擇離子豐度最高、基質干擾最小的2個離子對作為特征離子對，其中信號較大的離子對作為定量離子對。在最佳條件下，9種目標化合物能夠進行定性與定量檢測，如圖1所示。

2.3分散吸附劑的選擇

以回收率及凈化效果為指標，考察50 mg PSA（N-丙基乙二胺）、50 mg C?18、50 mg GCB（石墨化炭）3種分散吸附劑的凈化效果。在添加0.1 mg/kg的目標化合物水平下，按照“1.3”方法進行提取，提取液分別用以上3種分散吸附劑進行凈化，以糙米為例，測得的回收率見圖2。結果表明，采用PSA凈化時，凈化效果較差，基質效應最大，導致甲拌磷亞砜、硫酮菌唑、氟蟲腈硫醚等農藥的回收率均高于120%，相對標準偏差較大;采用GCB凈化時，GCB對丙硫菌唑和硫酮菌唑幾乎完全吸附;而采用C?18凈化時，9種化合物的回收率結果最優（94.6%～111.0%），相對標準偏差為1.9%～5.9%，基質效應較小，符合檢測方法的要求。進一步優化C?18吸附劑的用量，發現C?18用量為50 mg時，目標化合物的回收率最高。綜合考慮，最終選擇50 mg C?18作為凈化吸附劑。

2.4方法學驗證

2.4.1線性范圍、檢出限、定量限和基質效應。

按照“1.6”方法對空白樣品進行處理，然后配制0.005～0.500 mg/L系列空白基質匹配標準溶液和純溶劑標準溶液，其在糙米、面粉、玉米、白菜和蘋果這5種樣品基質中檢測的結果列于表2。由表2可知，9種化合物在5種基質中均表現基質抑制效應，其中大部分為中等和強的基質抑制效應，所以該試驗采用基質匹配標準溶液的方法，來降低基質效應的影響。5種基質中9種化合物在0.005～0.500 mg/L均呈良好的線性關系，相關系數（r）為0.995 9～0.999 9，檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.01～3.46和0.04～8.99 μg/kg。

2.4.2準確度和精密度。

從表3可看出，在0.01、0.10和?1.00 mg/kg 3個添加水平下，糙米、面粉、玉米、白菜和蘋果基質中9種化合物的平均回收率分別為74.4%～95.1%、73.4%～102.0%、80.2%～105.0%、73.4%～102.0%和71.2%～?102.0%，相對標準偏差分別為3.86%～16.70%、1.98%～?11.70%、?2.30%～8.95%、2.76%～8.04%和1.28%～15.60%。表明該方法有較好的準確性和穩定性，滿足農藥殘留分析的?要求。

3結論與討論

建立同時檢測甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物的多殘留檢測方法，首先是色譜檢測條件的優化。在三重四級桿串聯液質儀條件下，獲得穩定的分析條件需要對流動相配比進行優化。微量的甲酸（0.1%）和乙酸銨（5 mmol/L）均可明顯改善峰型，并且響應值隨著甲酸的濃度增大而增大。有機相中選擇甲醇比乙腈的響應值更高。因此，經優化后最終采用5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液和甲醇作為流動相。

9種化合物在5種基質中均表現基質抑制效應，其中大部分為中等和強的基質抑制效應，所以該試驗采用基質匹配標準溶液的方法，來降低基質效應的影響。樣品基質中存在不同的雜質，用吸附劑進行分散固相萃取，是常用的凈化方法。PSA（N-丙基乙二胺）主要是去除糖類和有機酸等，GCB（石墨化炭）主要用于去除色素，C?18主要用于去除脂類干擾，通過凈化效果比較，選擇C?18作為吸附劑，可以取得良好的凈化效果和滿意的回收率（94.6%～111.0%）。

該研究建立了QuEChERS方法凈化，超高效液相色譜串聯質譜檢測農產品中甲拌磷、丙硫菌唑和氟蟲腈及其代謝物殘留的檢測方法。該方法簡單、快速、準確、靈敏度高，滿足痕量分析要求，適用于糙米、面粉、玉米、白菜和蘋果等農產品中農藥殘留的檢測。

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