HRGC-HRMS法和CALUX法測定造紙廢水中二噁英的研究

趙金平，黃博珠，徐小靜，鐘英立，陳蓉，張貴剛，肖文，向運榮

廣東省環境監測中心，廣東 廣州 510308

二噁英類（Dioxins）是多氯二苯并-對-二噁英（PCDDs）和多氯二苯并呋喃（PCDFs）的統稱，是一類具有急性致死毒性，高致癌、致畸、致突變，內分泌干擾及具有生殖和發育毒性的持久性有機污染物（Hites，2011；Schecter et al.，2006）。制漿造紙被被列為中國二噁英排放重點源和二噁英減排優先控制重點行業之一（王軍玲等，2011；楊傳璽等，2014）。目前國內對垃圾焚燒行業二噁英排放關注度較高（李雁等，2019；楊文武等，2019；林斌斌等，2018），作為制漿造紙行業中二噁英主要來源的漂白工藝雖然日漸得到關注（楊玲等，2006），但對氯漂白工段產生的二噁英研究相對較少。

高分辨氣相色譜-高分辨質譜（high resolution gas-high resolution mass spectrometer，HRGCHRMS）由于其極低的檢測限、高靈敏度、高選擇性，定性定量準確等優點是目前化學分析的主要方法，但由于該方法樣品前處理步驟繁瑣，處理周期長、成本高，對定性、定量用的標準樣品有很高的要求，同時對實驗室和操作人員也有較高要求，使得該方法無法被廣泛應用且數據獲得速度較慢。目前，國內外已經研究出多種二噁英生物檢測法方法（如EPA 4405、4425、4435方法），該方法可快速開展二噁英的篩選檢測（周志廣等，2013；Wang et al.，2012），為造紙行業中二噁英監管提供可行性。

本研究通過對珠三角兩家典型制漿造紙廠的氯漂白工段廢水的監測，基于 HRGC-HRMS方法和國內應用較廣的生物檢測方法（熒光素酶的化學激活報告基因方法（Chemically Activated LUciferase eXpression，CALUX））開展二噁英的分析（周志廣等，2013；籍龍杰等，2016；許利等，2016；周志廣等，2011），掌握制漿造紙廠氯漂白工段廢水二噁英排放特征，同時了解HRGC-HRMS法和 CALUX法分析二噁英的可比性，以期為CALUX方法應用于造紙行業二噁英快速篩選和分析提供科學依據，進而為管理部門的行業決策提供及時有效的數據支撐。

1 樣品采集與分析

1.1 樣品的采集

依據 HJ77.1—2008《水質 二噁英類的測定 同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質譜法》，選取珠三角兩家典型具有氯漂白工序的制漿造紙企業（企業A和企業B），于2019年1月中下旬進行樣品采集，每家企業現場各采集3個樣品，每個樣品采集的廢水量為40 L，水樣富集（速率為50 mL·min-1）過程要防止廢水不經濾膜直接滲漏，在濾膜發生堵塞的情況下及時更換濾膜。最終獲得樣品7個（包括1個現場空白），除了現場空白，其他6個樣品均包括顆粒相和水相。

采樣前，XAD-2樹脂和聚氨基甲酸乙酯泡沫用去離子水和丙酮清洗3遍后真空干燥，再依次用甲苯和二氯甲烷各進行索氏提取24 h，凈化后的樹脂再次真空干燥后備用；0.45 μm混合纖維微孔濾膜（直徑為200 mm，上海新亞），使用前拆封并用甲苯沖洗3遍后使用；固相萃取儀各關鍵部分使用前依次用甲醇、丙酮、二氯甲烷浸濕的脫脂棉擦拭干凈。采樣前 XAD-2樹脂、聚氨基甲酸乙酯泡沫和濾膜先用甲苯溶劑潤濕，廢水采集結束后，樣品密封，低溫保存，運回實驗室存放于-20 ℃冰箱。

1.2 樣品提取、分樣與凈化

實驗用到的試劑和凈化材料包括以下幾種：二噁英標樣、農殘級正己烷、甲苯、二氯甲烷、丙酮、甲醇、、壬烷標準品；優級純濃硫酸。其他材料包括：超純中性硅膠（60－120目）、酸性活化氧化鋁、石墨化活性炭、Celite 545硅藻土、XAD-2樹脂、無水硫酸鈉等。

CALUX方法用到的材料包括：CALUX細胞株（Xenobiotic Detection System International，Inc.）、磷酸鹽緩沖鹽片（生物級）、無菌移液管、細胞培養皿、錐形/尖底無菌聚丙烯離心管、彈扣蓋式低吸附無菌微量離心管、96孔底透微孔板、可立外旋凍存管、96微孔板封板膜、胎牛血清（澳洲源）、熒光霉素試劑盒、ULR-移液器吸頭、NEST加樣槽、細胞培養基（RPMI 1640）、胰蛋白酶[0.5%Trypsin-EDTA(10×)，no Phenol Red]、青鏈霉素混合液等。

經冷凍干燥后的樣品，用300 mL甲苯索氏抽提24 h。提取后的液體經濃縮近干，用16 mL二氯甲烷將樣品分多次轉移至22 mL樣品瓶中，氮吹干，將樣品用正己烷轉移至10 mL容量瓶中定容。將10 mL樣品一分為二，一份用于 HRGC-HRMS分析，一份用于CALUX分析。

開始凈化前，在用于 HRGC-HRMS分析的樣品中加入 20 μL 100/200 ng·mL-1EPA-1613 LCS 提取內標，用于CALUX分析的樣品不加提取內標。樣品經濃硫酸凈化，依次過酸性硅膠柱、酸性氧化鋁柱和碳層析柱凈化。凈化洗脫液經濃縮、氮吹轉移至尖底瓶中，樣品自然晾干后，用于HRGC-HRMS分析的樣品加入 20 μL 100 ng·mL-1EPA-1613ISS 進樣內標至尖底樣品瓶中，待高分辨儀器分析。

用于CALUX分析的樣品經上述方法凈化后，往晾干的樣品瓶中加入 200 μL二甲基亞砜（DMSO），在 18 ℃以上避光保存，待分析。進行生物試驗時，從上述樣品瓶中取出4.5 μL樣品，加入 450 μL PRMI 1640培養液（1% Penicillinstreptomycin+8% FBS）后混勻。在已添加了細胞的96孔板上，每孔加入100 μL混合液，培養24 h（生物培養箱環境為 37 ℃，CO2的體積分數為5%）。采用化學發光酶標儀測量發光度，通過發光度計算PCDD/Fs濃度。

1.3 儀器分析

HRGC-HRMS的分析條件如下：高分辨氣相色譜/高分辨雙聚焦磁式質譜聯用儀，載氣流速為1.0 mL·min-1，色譜柱為 HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm），進樣量為1 μL，不分流進。色譜柱升溫程序：初始溫度為170 ℃保持1.5 min，然后以 20 ℃·min-1的速率升至 220 ℃，1.0 ℃·min-1升至 240 ℃，最后，以 5 ℃·min-1升至 300 ℃, 保持9 min。進樣口溫度為280 ℃。質譜條件：分辨率大于10000，溶劑延遲時間20 min，電子轟擊源：EI，離子源溫度：280 ℃，SIM掃描模式，傳輸管線溫度：280 ℃。

CALUX的檢測儀器酶標儀（Centro XS3LB 960）參數設置如下，Dispense條件：Injector為3，Volume為100，Speed為middle，Measure operation為 by well，Repeated operation 為 Yes；Kinetic條件：Total Time為10.0，Counting Time為1.00，Repeats為 11，Delay 為 0.0，Measure operation 為 by well。

1.4 質量保證與質量控制

無論是HRGC-HRMS方法還是CALUX方法，實驗過程中均分析了1個現場空白和1個實驗室空白，HRGC-HRMS檢測結果顯示，現場空白和實驗空白中OCDD是主要干擾物，但是其檢出的濃度均小于方法檢出限，因此可以忽略；CALUX檢測結果顯示，現場空白和實驗空白中均未檢出二噁英類化合物，滿足方法要求（CV值＜20%）。HRGC-HRMS提取內標回收率在54.4%－124%，符合國標HJ77.1—2008方法的質控要求。

表1 制漿造紙廢水中二噁英檢測結果表Table 1 Detected results of dioxin in waste water pg·L-1

2 結果與討論

2.1 HRGC-HRMS檢測廢水二噁英污染特征

表1給出了兩家造紙企業氯漂白工段后廢水中二噁英的污染特征。從中可以看出A企業廢水中二噁英的質量濃度為 1481－2124 pg·L-1，均值為1712 pg·L-1，毒性當量為 19.0－25.5 pg·L-1，均值為21.4 pg·L-1；B企業廢水中的二噁英的質量濃度為 12.4－20.8 pg·L-1，均值為 17.6 pg·L-1，毒性當量為 1.46－2.16 pg·L-1，均值為 1.89 pg·L-1。A 企業氯漂白工藝產生廢水中二噁英濃度均值和毒性當量均值分別是B企業的97.3倍和11.3倍。按照GB3544—2008《制漿造紙工業水污染物排放標準》中車間或生產設施廢水排放口二噁英的排放限值（30 pg·L-1）毒性當量評價，兩家企業廢水中二噁英均未超標。表 1同時給出了兩家企業廢水中二噁英的指紋信息，對于分析二噁英的產生機制與來源解析有重要意義。由表中可以看出，A企業以PCDDs為主，占整個二噁英濃度水平的98.3%－98.6%，是PCDFs的56.9－68.8倍；而B企業則以PCDFs為主，占整個二噁英濃度水平的 58.7－60.8倍，是 PCDDs的 1.4－1.5倍。A企業的單體分布特點與付建平（2013）研究的珠三角造紙行業中二噁英單體分布特征基本一致，B企業則與青憲等（2014）報道的某造紙廢水中二噁英分布特征一致。兩家企業廢水中PCDD/Fs單體特征不一致，說明即使二噁英產生的主要環節在漂白工藝，但企業漂白工藝的不同可能是直接影響二噁英產生的主要原因，這與兩家企業目前采取的漂白工藝不同也是一致的，A企業制漿漂白工段主要是氧化氯漂白技術，B企業則除了氧化氯，主要采用臭氧漂白技術。此外，造紙來源的不同可能是另外一個影響企業廢水中二噁英產生另外一個重要原因。有文獻報道，廢水中較高含量的OCDD，反映了五氯酚可能是二噁英污染的主要來源（Zheng et al.，2001），而五氯酚曾用于造紙行業中木材、紙漿及紙制品的防腐（楊左軍等，2010），A企業造紙的原材料是以桉木為主，竹子為輔的混合材料，B企業則是以木材為原材料。

與同類研究相比，A造紙漂白工段廢水中二噁英濃度1481－2124pg·L-1，高于青憲等（2014）報道的造紙廢水、付建平等（2013）研究珠三角7家造紙廠廢水和Zheng et al.（2001）報道的造紙廢水中二噁英濃度 239 pg·L-1、4.75－80.05 pg·L-1（均值為 36.16 pg·L-1）和 744.5 pg·L-1，但就毒性當量而言，A企業廢水中二噁英毒性當量為 19.0－25.5 pg·L-1，低于青憲等（2014）和 Zheng et al.（2001）的研究結果 41.0 pg·L-1和 315.6 pg·L-1的毒性當量水平，低于Wang et al.（2012）在2012年報道的我國6家造紙廠次氯酸鹽漂白工藝排放廢水中二噁英毒性濃度水平 6.51－261 pg·L-1（均值為 83.21 pg TEQ·L-1），同時低于王志芳等（2012）報道的草漿和葦漿造紙企業二噁英毒性當量41.8－125 pg·L-1；但高于付建平等（2013）研究的珠三角造紙廢水二噁英毒性當量水平 0.21－2.02 pg·L-1（均值為 1.00 pg·L-1），同時也高于王志芳等（2012）報道的竹漿和蔗渣漿造紙企業二噁英毒性當量 7.46－19.7 pg·L-1。就B企業而言，無論是廢水中二噁英濃度水平還是其毒性當量，均明顯低于文獻報道值。

表2 造紙廢水中二噁英的生物檢測結果Table 2 Detected results of dioxin in waste water by CALUX method

2.2 CALUX檢測廢水二噁英毒性當量水平

CALUX方法是基于生物基因，把小鼠的細胞色素 P450基因啟動子（CYP1A1）和螢火蟲的熒光素酶合成基因，重組到小鼠肝癌細胞上。二噁英類的脂溶性污染物透過細胞膜與細胞內芳香烴受體（AhR）可逆性結合成配體，進入細胞核內。在細胞核內配體-AhR與核內轉運蛋白（ARNT）結合，形成配體-AhR-ARNT復合物，特異性的復合物與染色體上的二噁英表達區域（DRE，Dioxin Response Element）結合，并激活細胞合成熒光素酶（許利等，2016；張諾等，2014）。該測試系統合成的熒光素酶量及熒光強度與測定系統中加入的二噁英量呈正相關，熒光強度則可以通過酶標儀進行讀取，從而獲得二噁英總的毒性當量水平。

表2所示為CALUX法測定的6個廢水中二噁英的毒性當量。從中可看出采用CALUX法檢測的3次結果基本相同，除了A企業第3個樣品3次檢測CV值超過10%外，其他樣品均控制在5%以內，最低的僅為1.8%，空白樣品3次檢測結果均為未檢出，可見其整個實驗流程和實驗耗材的預處理達到CV值應＜20%質控要求。同時可以看出，CALUX法二噁英毒性當量的實測值均高于 HRGC-HRMS檢測出的廢水中二噁英的毒性當量結果，主要原因是CALUX法在檢測二噁英類化合物的過程中，測定的樣品中可能含有其他會激活 AhR受體的芳烴類物質（周志廣等，2013），如果凈化過程能將芳烴類物質去除，則儀器法和生物法值將更接近；此外，儀器法和生物法中毒性當量系數不同也是造成偏差的原因（Anezaki et al.，2009）。

如果按照《制漿造紙工業水污染物排放標準》（GB3544—2008）中30 pg·L-1毒性當量排放限值評價，可以看出A企業毒性當量33.8－37.5 pg·L-1（均值為35.3 pg·L-1）稍微高于排放限值，因此，在實際監測過程中需要對該結果進行核實。雖然表1給出的 HRGC-HRMS檢測結果未超標，但其毒性當量也接近GB3544—2008中規定的廢水中二噁英的排放限值，所以對其進行核實意義重大。B企業廢水中二噁英毒性當量為 4.44－6.52 pg·L-1（均值為5.75 pg·L-1），遠低于排放限值，無需再用HRGC-HRMS法核實，表1中給出的B企業檢測結果同樣也是遠低于廢水中二噁英排放限值，兩種方法結果是一致的。A企業3次CALUX法檢測值分別是HRGC-HRMS法檢測結果的1.8、1.8、1.5倍；B企業CALUX法檢測值分別是HRGC-HRMS法檢測結果的 3.2、2.9、3.1倍，由此可知，就兩種方法而言，對于濃度較高的廢水樣品，CALUX法檢測值與HRGC-HRMS檢測值更接近。

2.3 HRGC-HRMS與CALUX檢測結果的相關性

圖1所示為造紙廢水中二噁英HRGC-HRMS法與CALUX法檢測結果之間的相關性。從圖中可以看出，B企業兩種方法檢測結果之間相關性較好，3個樣品的r2分別為0.95、0.93和0.95；A企業兩種方法檢測結果的r2則分別為0.59、0.99和0.52。由此可知，HRGC-HRMS法與CALUX法對6個樣品檢測結果均呈現正相關，但由于樣品量較少，且CALUX法也僅僅做了3次獨立實驗，所以樣品獨立實驗結果的相關性還存在一定的差異。但3次CALUX法獨立實驗結果之間的CV值較低更能反映結果的可靠性，以及與HRGC-HRMS法檢測結果之間的倍數可比性更能說明生物法的準確度。

CALUX法雖然只測定了2, 3, 7, 8-取代二噁英類總毒性當量（如表2），不能給出如表1所示17種二噁英單體化合物的濃度特征，但由于其周期短、分析成本低，可平行測定大量樣品，同時對環境樣品的檢出限可以達到pg·g-1或ng·L-1水平的特點，因此將其應用于大規模二噁英類背景或污染調查具有儀器法無可比擬的優勢。從兩種方法檢測結果的對比來看，同樣顯示出CALUX法應用于二噁英檢測的可行性和可操作性。

圖1 造紙廢水樣品HRGC-HRMS法與CALUX法檢測結果的相關性Fig. 1 Correlation of results between HRGC-HRMS and CALUX method

3 結論

應用HRGC-HRMS法和CALUX法測定了珠三角兩家典型具有氯漂白工藝的制漿造紙企業廢水中二噁英污染特征和毒性當量水平，結果可為珠三角地區具有氯漂白工藝的制漿造紙企業二噁英的污染防治和監管提供了數據支撐和技術支持，并將CALUX法有效應用于制漿造紙企業廢水中二噁英的快速檢測，進而節約企業和管理部門二噁英檢測成本、時間成本。

CALUX法與目前普遍采用的HRGC-HRMS法相比，后者檢測值會偏低一些，但較為準確；前者則由于其快速，檢測靈敏度和準確性等近似于HRGC-HRMS，同時低成本和分析周期短的特點，則適用于大規模二噁英樣品的快速半定量篩選。將CALUX法和HRGC-HRMS法結合，可確保數據的快速和精準，有助于企業和管理部門對二噁英污染情況進行及時防控和有效監督。