養(yǎng)殖蝦塘常見(jiàn)耐藥菌的分離鑒定與耐藥基因檢測(cè)

葉繁，馮時(shí)歡，吳佳佳, ，戴志遠(yuǎn),

1. 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江 杭州 310012；2. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；3. 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310012

抗生素濫用不斷誘導(dǎo)細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生抗性，目前，抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）已成為難以降解的新型環(huán)境污染物。ARGs能在環(huán)境中長(zhǎng)期殘留，并在細(xì)菌菌群間遷移，同時(shí)可能通過(guò)直接接觸或食物鏈污染等多種途徑進(jìn)入人體，增加人體的抗生素抗性，使細(xì)菌感染性疾病的治療更加棘手（崔澤林等，2011）。中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素濫用問(wèn)題普遍，加之水體中抗生素本底水平較高，進(jìn)而使水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的檢出率不斷增加，一些水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物攜帶ARGs也被不斷檢出（黃志堅(jiān)等，2012）。

喹諾酮類抗生素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是目前中國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中常用的兩類抗生素。王敏等（2011）在濱海典型養(yǎng)殖區(qū)的不同養(yǎng)殖水環(huán)境中采集樣本，從中檢測(cè)出了3類7種抗生素殘留，其中，喹諾酮類藥物諾氟沙星在蝦池的檢出量最高，為3.54 ng·L-1。郭鵬（2009）對(duì)44株水產(chǎn)源嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)環(huán)丙沙星、恩諾沙星抑菌率分別達(dá)97.67%、97.67%。葛錚（2015）從淡水魚(yú)類中分離獲得維氏氣單胞菌（Ae. veronii），測(cè)定最小抑菌濃度，結(jié)果表明分離的維氏氣單胞菌對(duì)慶大霉素、阿莫西林、紅霉素全部耐藥；對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星的耐藥率分別為78.85%、57.69%。Vaseeharan et al.（2008）在印度對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)采集的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)有47.4%的細(xì)菌對(duì)紅霉素敏感。中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs的污染情況正愈發(fā)嚴(yán)重，并呈現(xiàn)多元化、復(fù)雜化的局面（張騫月，2016），著手水產(chǎn)環(huán)境 ARGs污染研究，對(duì)指導(dǎo)抗生素科學(xué)、合理使用，控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中ARGs污染并阻止其通過(guò)食物鏈遷移至人體、保障水產(chǎn)食品安全意義深遠(yuǎn)。

本研究以杭州蕭山地區(qū)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境的微生物為研究對(duì)象，利用抗性平板進(jìn)行抗生素抗性細(xì)菌初步篩選；借助16S rDNA序列分析技術(shù)探究分離菌株的分類信息；同時(shí)，對(duì)分離菌株 ARGs進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。研究結(jié)果可為掌握水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)中ARGs的污染現(xiàn)狀、了解其對(duì)養(yǎng)殖系統(tǒng)生態(tài)環(huán)境的影響、評(píng)估ARGs帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水樣和泥樣采集于杭州市蕭山圍墾某養(yǎng)殖廠的1號(hào)蝦塘和2號(hào)蝦塘，樣品置于無(wú)菌自封袋中，低溫（冰浴）運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃冰箱中保存，并在24 h內(nèi)進(jìn)行微生物分離實(shí)驗(yàn)。1號(hào)塘為露天養(yǎng)殖塘；2號(hào)塘為大棚養(yǎng)殖塘（該塘藍(lán)藻爆發(fā)，水體富營(yíng)養(yǎng)化）。

2216E培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖（Agarose，北京沃比森科技有限公司）；諾氟沙星（Norfloxacin）、紅霉素（Erythromycin）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）。

1.2 耐藥菌的培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

取20 g泥樣（或20 mL水樣）溶于含180 mL 0.85%無(wú)菌生理鹽水。梯度稀釋后分別涂布于2216E瓊脂平板、含諾氟沙星（16 mg·L-1）2216E瓊脂平板和含紅霉素（8 mg·L-1）2216E 瓊脂平板上，30 ℃培養(yǎng)48 h，分別對(duì)3種平板上的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3 菌株純化

從上述諾氟沙星和紅霉素抗性平板上隨機(jī)挑選菌落形態(tài)有明顯差異的菌株進(jìn)行兩次劃線純化培養(yǎng)，并將第二次分離純化后的單菌落接種到含 5 mL 2216E液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，獲得新鮮菌液，取一定量新鮮菌液與等體積70%無(wú)菌甘油混合后于-80 ℃凍藏，備用。

1.4 細(xì)菌DNA提取

取新鮮菌液3 mL，按照細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行細(xì)菌DNA提取和純化。采用Nanodrop MN-913超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取 DNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 Primers for ARGs amplification

1.5 ARGs PCR擴(kuò)增

以細(xì)菌基因組DNA為模板，采用25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2.5 μL 10×LA buffer(Mg2+plus)，2 μL dNTP Mix（2.5 mmol·L-1），引物各 1 μL，0.2 μL LA Taq（5 U·μL-1），1 μL DNA 模板，17.3 μL ddH2O。引物序列見(jiàn)表1。

反應(yīng)條件：

（1）gyrA：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 30 s，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

（2）ermB：93 ℃預(yù)變性3 min；93 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，隨機(jī)挑取部分陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.6 16S rDNA PCR擴(kuò)增

以細(xì)菌基因組DNA為模板，參考袁開(kāi)等（2017）方法完成16S rDNA的擴(kuò)增。50 μL反應(yīng)體系：5 μL 10×LA buffer（Mg2+plus），4 μL dNTP Mix （2.5 mmol·L-1），引物各 3 μL，0.3 μL LA Taq（5 U·μL-1），1 μL DNA模板，33.7 μL ddH2O。擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，并基于MEGA 5.1軟件構(gòu)建耐藥菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（Saitou et al.，1987；Felsenstein，1985；Tamura et al.，2004；Tamura et al.，2011）。

1.7 數(shù)據(jù)處理及分析

運(yùn)用Origin 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析并作圖；運(yùn)用 MEGA 5.1進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建，采用最大似然法（maximum composite likelihood method）和鄰接法（neighbour-joining method）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，Boostrap值為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 養(yǎng)殖蝦塘中耐藥菌的分布

4個(gè)采樣點(diǎn)細(xì)菌總數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，2號(hào)泥樣中可培養(yǎng)菌落總數(shù)最高，為 1.1×107CFU·mL-1，1號(hào)水樣可培養(yǎng)菌落總數(shù)最低，為2.0×105CFU·mL-1。如圖1所示，4個(gè)采樣點(diǎn)均存在耐紅霉素細(xì)菌，而耐諾氟沙星細(xì)菌只存在于底泥樣品中。雖然水樣細(xì)菌在諾氟沙星抗性平板上未出現(xiàn)菌落，但不能完全代表蝦塘中不存在耐諾氟沙星細(xì)菌，由于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件并不能完全模擬蝦塘生長(zhǎng)環(huán)境，許多環(huán)境細(xì)菌并不能在人工培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)繁殖。養(yǎng)殖蝦塘細(xì)菌對(duì)紅霉素耐藥率較高，且耐紅霉素細(xì)菌數(shù)比耐諾氟沙星細(xì)菌數(shù)高1－2個(gè)數(shù)量級(jí)。1號(hào)和2號(hào)蝦塘泥樣細(xì)菌對(duì)諾氟沙星的耐藥率分別為0.36%、0.82%；1號(hào)蝦塘泥樣和水樣中細(xì)菌對(duì)紅霉素的耐藥率分別為23.33%、18.50%，2號(hào)蝦塘泥樣和水樣中細(xì)菌對(duì)紅霉素的耐藥率分別為20.00%、12.50%。

圖1 養(yǎng)殖蝦塘中菌落總數(shù)及抗生素耐藥率Fig. 1 Total number of colonies and antibiotic resistance rate of the bacteria in shrimp ponds

2.2 ARGs PCR檢測(cè)

4個(gè)采樣點(diǎn)均存在耐紅霉素細(xì)菌，而耐諾氟沙星細(xì)菌只存在于底泥樣品中。在 6個(gè)抗性平板上分別挑選10株菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，即20株耐諾氟沙星菌株和40株耐紅霉素菌株，共計(jì)60株。采用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行耐藥基因的PCR擴(kuò)增。

60株菌株耐藥基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在16株菌株中檢出gyrA基因，在30株菌株中檢出ermB基因，片段大小與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致（見(jiàn)圖2、圖 3）。

圖2 部分菌株ermBPCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR amplicons of ermB

兩種ARGs檢出率如下：喹諾酮類ARGs gyrA基因的檢出率為26.67%，大環(huán)內(nèi)酯類ARGs ermB基因的檢出率50.00%。另外按蝦塘分類，1號(hào)蝦塘gyrA基因的檢出率較高，為43.33%；ermB基因的檢出率較低，為30.00%；2號(hào)蝦塘gyrA基因的檢出率為10.00%，ermB基因的檢出率為70.00%。

圖3 部分菌株gyrA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 3 PCR amplicons of gyrA

2.3 菌株鑒定結(jié)果

隨機(jī)挑取陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果如表2。

Blast比對(duì)結(jié)果顯示，所得21個(gè)16S rDNA基因序列與 Genebank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中已有序列相似性達(dá) 99%－100%，具體鑒定結(jié)果如下：南極適冷菌（Rheinheimera sp.）7株、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）6株、微桿菌（Microbacterium sp.）3株、廈門(mén)希瓦氏菌（Shewanella xiamenensis）2株、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）2株、豚鼠氣單胞菌（Ae. caviae）1株。1號(hào)蝦塘共鑒定出2個(gè)屬，66.67%為不動(dòng)桿菌屬，33.33%為微桿菌屬；2號(hào)蝦塘共鑒定出3個(gè)屬，3個(gè)種，其中南極適冷菌最多，占58.33%，其余包括廈門(mén)希瓦氏菌、豚鼠氣單胞菌、嗜水氣單胞菌。耐藥基因PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)分析后表明，1號(hào)蝦塘中所測(cè)菌株擴(kuò)增出的gyrA基因序列與約氏不動(dòng)桿菌（Ac. johnsonii）的相應(yīng)耐藥基因序列的相似性均為97%；而2號(hào)蝦塘中所測(cè)菌株擴(kuò)增出的 gyrA基因序列與奧奈達(dá)希瓦氏菌（Sh. oneidensis）相應(yīng)的耐藥基因序列的相似性均為97%，2號(hào)蝦塘中挑取的ermB基因序列均與釀膿鏈球菌（St. pyogenes）相應(yīng)的耐藥基因序列相似度最高（99%－100%）。

2.4 16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

從Genebank選取模式菌株16S rDNA序列，與21株測(cè)序菌株的16S rDNA序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖 4。獲得的菌株分布于變形菌門(mén)和放線菌門(mén)2個(gè)門(mén)級(jí)分類單元中，除菌株1-4、1-5、1-8與放線菌門(mén)的Microbacterium aureliae遺傳距離較近外，其余菌株均聚類于γ-變形菌綱。2號(hào)蝦塘大部分菌株的遺傳特征比較接近，菌株2-1、2-3、2-5、2-6、2-7、2-8、2-10與Rheinheimera soli的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最密切；1號(hào)蝦塘多數(shù)菌株與 Ac. johnsonii聚為一簇。

表2 菌株鑒定結(jié)果Table 2 Bacterial typing and identification

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，蝦塘泥樣中菌落總數(shù)及耐藥菌總數(shù)均高于其對(duì)應(yīng)水樣中的數(shù)量，這是因?yàn)槲r塘中細(xì)菌數(shù)量主要決定于有機(jī)物的濃度（劉國(guó)才等，2000）；而在養(yǎng)殖池塘系統(tǒng)中，大量殘餌、生物代謝物、生物殘?bào)w等有機(jī)物不斷沉積在池底，使得底泥環(huán)境更有利于細(xì)菌繁殖生長(zhǎng)（李爍寒等，2009）。Gao et al.（2012）通過(guò)對(duì)天津市6個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)中的四環(huán)素類抗性基因和磺胺類抗性基因及抗性菌株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)底泥中抗藥細(xì)菌數(shù)量和抗生素抗性基因濃度都遠(yuǎn)高于水中，說(shuō)明沉積物可能是抗性細(xì)菌和抗性基因的重要儲(chǔ)存庫(kù)。

已有研究報(bào)道指出，在水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的動(dòng)物體內(nèi)和環(huán)境中發(fā)現(xiàn)多重抗藥菌株的存在。Novick（1981）指出在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中使用亞治療劑量的抗生素會(huì)促進(jìn)產(chǎn)生多重抗藥性菌株。Tendencia et al.（2001）在菲律賓的一個(gè)蝦塘中發(fā)現(xiàn)與未使用過(guò)抗生素的池塘相比，使用過(guò)惡喹酸的蝦塘里出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象的菌株更多。本研究基于PCR檢測(cè)耐藥菌株中的耐藥基因，也發(fā)現(xiàn)1號(hào)蝦塘和2號(hào)蝦塘中各存在2株菌株出現(xiàn)交叉耐藥現(xiàn)象。

對(duì)蝦塘中分離耐藥菌鑒定結(jié)果顯示，1號(hào)、2號(hào)蝦塘中分布的耐藥細(xì)菌種類不盡相同。其中，1號(hào)蝦塘耐藥菌以不動(dòng)桿菌為主，2號(hào)蝦塘中南極適冷菌所占比例最高，其次為希瓦氏菌屬和氣單胞菌屬。不動(dòng)桿菌、希瓦氏菌、嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌為致病菌，容易引起細(xì)菌性疾病，在機(jī)體免疫力下降時(shí)還會(huì)引起人體胃腸道、肺部等部位感染，微桿菌和南極適冷菌的致病性尚未明確。嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌是對(duì)蝦養(yǎng)殖中的常見(jiàn)條件致病菌，容易引起紅腿病、爛鰓病、敗血病等（徐曉津等，2001）。氣單胞菌利用能量的能力較強(qiáng)，當(dāng)水體富營(yíng)養(yǎng)化后，就會(huì)優(yōu)先利用有機(jī)物進(jìn)行繁殖，從而抑制其他細(xì)菌的繁殖，使水體中物質(zhì)循環(huán)受到阻礙（羅璋，2007）。采樣期間 2號(hào)蝦塘正值藍(lán)藻爆發(fā)，水體處于富營(yíng)養(yǎng)化狀態(tài)，這可能是其中氣單胞菌較1號(hào)蝦塘多的原因。

圖4 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences

本研究鑒定的細(xì)菌最終歸屬于2個(gè)綱5個(gè)屬，其中γ-變形菌綱數(shù)量最多。Nair et al.（2012）研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)是河水、海水以及海洋底泥中的主要類群。竇研等（2015）也發(fā)現(xiàn)在中國(guó)渤海和黃海等地海水養(yǎng)殖池塘的沉積物中，優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。2號(hào)蝦塘多數(shù)菌株與Rheinheimera soli的模式菌株NR_044294.1聚為一簇；1號(hào)蝦塘多數(shù)菌株與Ac. johnsonii的模式菌株MK294307.1聚為一簇。從聚類分析結(jié)果看出，來(lái)源相同的多數(shù)菌株聚為一類，兩個(gè)蝦塘的抗性菌種有較大差異，這可能是因?yàn)槁短祓B(yǎng)殖和大棚養(yǎng)殖水體營(yíng)養(yǎng)差異造成了抗性菌菌群分布各異。兩個(gè)蝦塘檢出的 gyrA基因序列分別與約氏不動(dòng)桿菌和奧奈達(dá)希瓦氏菌相應(yīng)的耐藥基因序列有很高的相似性（97%），而 ermB基因序列均與釀膿鏈球菌相應(yīng)的耐藥基因序列一致（99%－100%）。不同種屬的耐藥細(xì)菌，其攜帶的耐藥基因存在高度的相似性，這也說(shuō)明ARGs水平轉(zhuǎn)移、傳播可能普遍發(fā)生在不同細(xì)菌之間。高盼盼等（2009）指出，抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的濫用不僅會(huì)引起水生動(dòng)物體內(nèi)的抗生素殘留，而且在使用過(guò)程中未被水生生物吸收的抗生素以及隨水生生物糞便排泄的抗生素和穿過(guò)網(wǎng)箱未被生物食用的飼料中的抗生素最終溶入海水或隨懸浮物沉降匯集于底部沉積物。殘留在生物體內(nèi)和進(jìn)入環(huán)境中的抗生素會(huì)在養(yǎng)殖生物的腸道細(xì)菌內(nèi)和環(huán)境細(xì)菌內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生攜帶抗性基因的抗藥菌株，經(jīng)過(guò)質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移等機(jī)制將ARGs傳播給其他的細(xì)菌。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖蝦塘中耐藥細(xì)菌分離鑒定及 ARGs的檢測(cè)分析，初步了解蝦塘養(yǎng)殖環(huán)境中諾氟沙星和紅霉素兩種抗生素耐藥菌的種類及其耐藥基因污染情況。養(yǎng)殖蝦塘底泥和水體中均存在一定比例的耐藥菌，其中，蝦塘底泥和水體中紅霉素耐藥細(xì)菌的比例均高于 10%，且多數(shù)耐藥細(xì)菌攜帶相應(yīng)的ARGs。不同養(yǎng)殖模式蝦塘中耐藥細(xì)菌分布存在差異，水體富營(yíng)養(yǎng)化蝦塘中致病性氣單胞菌屬細(xì)菌數(shù)量較多；而健康養(yǎng)殖環(huán)境中，不動(dòng)桿菌和微桿菌等土著細(xì)菌攜帶ARGs比例也較高。由于ARGs在不同種屬細(xì)菌間水平遷移的概率較高，因此，掌握養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs污染現(xiàn)狀，對(duì)制定科學(xué)、合理的抗生素使用方案、減少ARGs在不同細(xì)菌、生境中的傳播擴(kuò)散具有重要意義。