高效液相色譜法測定半胱胺螯合鋅的含量

張倩云 趙威 徐振興 吳月敏 姜燕萍 盧立志 李浙烽 徐二華

（1，杭州康德權飼料有限公司，包膜飼料添加劑省級重點企業研究院 311107；2，浙江省農業科學院畜牧獸醫研究所 320021）

半胱胺螯合鋅是一種新型的飼料添加劑[1]，分子式為[H2NCH2CH2S]2Zn[2]，分子量為217.68，該產品具有化學性質穩定、生物學效價高、適口性好，降低環境污染等優勢，半胱胺螯合鋅的合成與在豬上面的生產應用有文獻報道[1，2]，但沒有含量檢測方法的報道，本研究建立了高效液相色譜法測定半胱胺螯合鋅含量的方法，為半胱胺螯合鋅質量標準的建立和產品質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

賽默飛U3000 高效液相色譜儀（備有紫外檢測器），變色龍6.8 色譜工作站。

半胱胺鹽酸鹽對照品（sigma，批號WXBC1602V），半胱胺螯合鋅樣品為杭州康德權飼料有限公司提供，批號為181226，190108，190110。

2 色譜條件與系統適應性試驗

色譜柱：Agela Technologies，Venusil MP C18 （ 4.6 ×150mm，5um）；流動相：乙腈：0.017mol/L 庚烷磺酸鈉溶液（取1.7g 庚烷磺酸鈉置于500ml 量瓶中，加入0.1mlH3PO4，然后用純水稀釋并定容至刻度）=15:85，進樣量5ul，檢測波長214nm；流速1ml/min。此色譜條件下，由半胱胺鹽酸鹽對照品溶液和供試品溶液分析可知，出峰時間一致，均為4.0min，且溶劑無干擾。

在上述色譜條件下分別取對照品溶液、供試品溶液和溶劑溶液各5ul 進樣分析，結果表明，理論板數按半胱胺計算不低于4000，色譜峰分離度良好，對照品、樣品和溶劑色譜圖見圖1。

3 方法與結果

3.1 溶液制備

對照品溶液：精密稱取對照品半胱胺鹽酸鹽1.5g，置100ml 量瓶中，加超純水約20ml 溶解，用超純水定容至刻度，搖勻，制每1ml 約含半胱胺10mg 的對照品溶液。

供試品溶液：稱取樣品約0.5g，精密稱定，置于100ml 容量瓶中，加鹽酸1+1 溶液0.5ml，加超純水約50ml，置于100℃沸水浴中水浴20min，取出放冷至室溫，加超純水定容至刻度，搖勻，備用。

溶劑溶液：取鹽酸1+1 溶液0.5ml，加超純水約50ml，置于100ml 量瓶中，加超純水定容至刻度。

3.2 線性關系考察

圖1 對照品（A）、樣品（B）、溶劑（C）液相色譜圖

分別精密量取半胱胺鹽酸鹽對照品溶液0.30，0.50，1.00，2.00，3.00ml，分別置10ml 量瓶中，加超純水溶解并定容至刻度，搖勻，分別得半胱胺濃度為0.306，0.510，1.021，2.042，3.063mg/ml 的溶液，分別進樣5ul 測定。以對照品溶液濃度（X，mg/ml）為橫坐標，以對照品峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，半胱胺回歸曲線方程為：Y=10.739X+0.3834 r2=0.9999，半胱胺在0.306～3.063mg/ml 范圍內，與峰面積成良好線性關系。

3.3 精密度試驗

取對照品溶液在上述色譜條件下連續進樣6 次，峰面積的RSD 結果為：0.89%。

3.4 重復性試驗

取同一批號的半胱胺螯合鋅6 份，批號為190110，每份取粉末約0.5g，精密稱定，按3.1 項下的方法操作。在上述色譜條件下進樣分析，計算半胱胺螯合鋅的平均含量為26.26%，RSD 為0.43%，重復性良好。

3.5 穩定性試驗

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0，2，4，6，8，12h，在上述色譜條件下進樣分析，計算半胱胺螯合鋅峰面積的RSD 為0.50%，結果表明，供試品溶液在12h 內穩定性良好。

3.6 回收率試驗

取已知含量的半胱胺螯合鋅9 份，批號為190110，每份取粉末約0.5g，精密稱定，分別精密加入低、中、高3 種濃度的對照品溶液，同上法操作，在上述色譜條件下分析，計算平均回收率。加樣回收率測定結果見表1。

3.7 樣品測定

精密稱取半胱胺螯合鋅樣品約0.5g，置于100ml 量瓶中，按3.1 項下的方法操作，在上述色譜條件下對3 批次半胱胺螯合鋅進行分析，計算含量，結果見表2。

3.8 檢出限與定量限

取半胱胺鹽酸鹽對照品適量，加超純水溶解并稀釋制成一系列濃度的溶液，取5ul 注入液相色譜儀，測得半胱胺鹽酸鹽（以半胱胺螯合鋅計算）最小檢出限為0.15ng （S/N≥3），定量限為0.45ng （S/N≥10）。

4 討論

4.1 流動相和波長的選擇

半胱胺螯合鋅中的活性物質為半胱胺，國家標準有關于飼料添加劑半胱胺鹽酸鹽的測定[3]，采用液相色譜法，故首先按照國家標準的流動相配置和儀器參數設置，測定半胱胺螯合鋅的樣品時，加50%甲醇水溶解，上機測定，在與對照品溶液主峰的保留時間相同的位置上，樣品也出峰，說明半胱胺活性成分被檢出。

表1 回收率試驗結果

表2 25%半胱胺螯合鋅含量測定結果（n=3）

4.2 溶劑的選擇

樣品溶劑首先選用的是國標要求的50%甲醇水，初始的3～5 個樣品峰型比較對稱，但峰面積不穩定，忽高忽低，且隨著樣品重復進樣數量加大，主峰色譜圖會形成嚴重的前延或拖尾峰，無法對主成分半胱胺進行定性定量，可能的原因為半胱胺螯合鋅直接溶于水后形成動態的解離，導致色譜柱分離效果變差。為了解決樣品動態解離問題，將溶解樣品的溶劑改成純水，并加入稍微過量的鹽酸1+1 溶液，使得樣品溶液為弱酸性，防止半胱胺螯合鋅的逆解離，影響色譜峰的面積和峰型，經過實驗，加入0.5ml 鹽酸1+1 溶液作為溶劑的樣品色譜圖峰型峰面積均穩定。

半胱胺鹽酸鹽的檢測目前有液相法，碘液滴定法[4]，本文獻研究物質為半胱胺螯合鋅，該方法檢測活性物質半胱胺，在酸性條件下經過解離成為半胱胺后，用半胱胺鹽酸鹽作為對照品測定含量。本研究建立了高效液相色譜法測定半胱胺螯合鋅的分析方法，使用的溶劑為水和鹽酸1+1 溶液，方法快速、準確、重復性好，可為半胱胺螯合鋅的質量控制方法。