腫瘤相關成纖維細胞的生物學特征及Transwell共培養對胃癌細胞生長和轉移的影響

邵久針，王穎鈺，印 鑫，許尤琪，沈明勤

(1. 南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院中藥藥理毒理實驗室,江蘇 南京 210028;2. 江蘇省中醫藥研究院中藥藥理毒理實驗室,江蘇 南京 210028;3. 江蘇省第二中醫院腫瘤科,江蘇 南京 210008)

胃癌是常見的惡性腫瘤，位于全球發病率第5位、死亡率第3位，而我國屬胃癌高發國家，發病與死亡例數約占世界的50%，是癌癥防治的重點[1]。癌癥的演化過程中，腫瘤細胞會積極募集成纖維細胞等基質細胞，營造低氧高酸性的腫瘤微環境，對腫瘤的發生、增殖、轉移和凋亡具有重要的調節作用[2]。在胃腸道腫瘤中，基質細胞占腫瘤質量的50%以上，與胃正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)相比，胃癌相關成纖維細胞(cancer associated fibroblasts，CAFs)作為存在于腫瘤間質中的成纖維細胞亞群，是腫瘤微環境中重要的基質細胞[3]，可通過分泌基質細胞衍生因子-1(stromal cell derived factor-1，SDF-1)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGFβ)、半乳糖凝集素-1(Galectin-1)等細胞因子，重塑細胞外基質[4]，促進腫瘤細胞的增殖、轉移，并增強腫瘤的耐藥性。

目前，研究偏向以傳統的單細胞培養或接觸式共培養模式，探究CAFs促癌增殖和轉移作用，而基于Transwell共培養體系探究CAFs與NFs對不同比例胃癌細胞影響的報道較少。本研究在分離鑒定原代人CAFs、NFs細胞及形態學特征的基礎上，通過構建CAFs/NFs-胃癌細胞Transwell共培養模型，探究成纖維細胞對不同比例胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及初步機制，既達到成纖維細胞與胃癌細胞非接觸式生長，又保證了細胞間正常信號傳導及相互影響，更接近于人體腫瘤微環境，為研究基于腫瘤微環境CAFs、NFs對胃癌細胞的影響提供研究思路、方法與參考。

1 材料

1.1 細胞與試劑人胃癌細胞MGC-803(貨號:HXC-0136)，購自南京宏新。胎牛血清(Gibco);DMEM不完全高糖培養液(江蘇凱基); CXCR4拮抗劑AMD3100(APExBIO);DAPI、BSA(Sigma);全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天);TRIzol(Invitrogen); cDNA第一鏈合成試劑盒、SYBR Green Master Mix (諾唯贊);Matrigel基底膠(BD);活性氧(reactive oxygen species，ROS)測定試劑盒、乳酸測定試劑盒(南京建成); α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(BM0002)、β-actin(BM0627)抗體，均購自博士德; 波形蛋白(Vimentin)抗體(ab92547)、羊抗兔二抗(ab6721)，均購自Abcam;羊抗鼠二抗(A21010-1)、Dylight488羊抗兔IgG(A23220)，購自Abbkine；Transwell 24孔板(Corning,costar3422聚碳脂膜, 膜直徑6.5 mm，孔徑8.0 μm);Transwell 6孔板(Corning,costar3412聚碳脂膜, 膜直徑24 mm，孔徑0.4 μm)。

1.2 儀器Heracell 150i二氧化碳培養箱、NanoDrop one紫外分光光度計、TCA5020普通PCR儀、ABI 7500熒光定量PCR循環儀、Varioskan flash全波長多功能酶標儀(Thermo Fisher);PowerPac Basic電泳儀(Bio-Rad);Primo Vert倒置顯微鏡、Axioskop 2 plus熒光顯微鏡(ZEISS); Spectrumlab 752s紫外可見分光光度計(上海棱光)。

2 方法

2.1 CAFs、NFs的分離純化及傳代培養收集于江蘇省第二中醫院腫瘤科接受胃癌手術切除治療患者的胃癌組織和配對癌旁組織標本，于冰上用含雙抗的PBS清洗，棄上皮和脂肪組織，剪至1 mm3組織塊，加入少量含20%胎牛血清及雙抗的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱靜置孵育，4～5 d換液后，每隔48 h換液。待細胞長滿后，以10%胎牛血清培養基進行常規傳代培養，取第3～9代成纖維細胞進行實驗。本研究獲得江蘇省第二中醫院倫理委員會批準，編號為201609001。

2.2 CAFs、NFs的鑒定

2.2.1形態學鑒定 倒置相差顯微鏡下觀察CAFs、NFs從組織塊分離純化情況，常規傳代培養，記錄其生長狀況和形態學特征。

2.2.2免疫熒光法檢測α-SMA、Vimentin 取對數生長期的CAFs、NFs，加入含蓋玻片的6孔板中，常規培養24 h后，4%多聚甲醛固定，0.5% Triton X-100溶液通透20 min，1% BSA封閉30 min。分別加入一抗α-SMA和Vimentin孵育過夜，二抗Dylight488孵育30 min，DAPI染核5 min，于熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

2.2.3qPCR檢測α-SMA、Vimentin TRIzol法提取CAFs、NFs總RNA，經濃度、純度測定符合要求后，用cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄cDNA，以α-SMA、Vimentin基因上、下游引物擴增，并進行實時熒光定量PCR，以GAPDH為內參照，在凝膠成像系統進行PCR結果分析。2-ΔΔCT法計算α-SMA、Vimentin基因的相對表達量。引物序列如下:GAPDH,5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′(forward primer),5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′(reverse primer);α-SMA,5′-TATCCCCGGGACTAAGACGG-3′(forward primer),5′-CACCATCACCCCCTGATGTC-3′(reverse primer);Vimentin,5′-CGGGAGAAATTGCAGGAGGA-3′(forward primer),5′-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3′(reverse primer)。

2.2.4Western blot檢測α-SMA、Vimentin 取對數生長期的CAFs、NFs裂解30 min，離心取上清液。BCA法測定蛋白含量，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，以α-SMA、Vimentin為一抗，β-actin為內參，4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加入ECL曝光顯色。

2.3 MTT法繪制CAFs、NFs的生長曲線取對數生長期的CAFs、NFs，以每孔4×103個接種至96孔板，設6個復孔及空白組，依次在培養0、1、2、3 d后，加入MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后棄上清，加入150 μL DMSO溶液后，振蕩10 min，于波長492 nm下測定各孔吸光度值，并繪制生長曲線。

2.4 成纖維細胞對不同比例胃癌細胞增殖和轉移的影響

2.4.1構建CAFs/NFs-腫瘤細胞Transwell懸掛式非接觸共培養體系 取CAFs、NFs，以每孔1.6×105個種植于Transwell 6孔板，24 h達到對數生長期后，調整MGC-803細胞密度分別為低密度1.2×108·L-1(L組)、中密度2.4×108·L-1(M組)、高密度4.8×108·L-1(H組)，每孔1.5 mL種植于Transwell小室共培養48 h，在確保共培養體系細胞高產出率的同時，又可體現不同比例共培養體系的差異性。同時設置上層為MGC-803細胞，下層為基礎培養液的空白對照(C組)。

2.4.2MTT法檢測細胞增殖活力 分別取CAFs、NFs共培養L、M、H組MGC-803細胞，以每孔4×103個接種于96孔板，設5個復孔及空白組，于0、1、2、3、4、5 d后進行MTT實驗，繪制細胞生長曲線。分別取48、72 h處吸光度值進行顯著性檢驗，分析共培養體系對胃癌細胞增殖活力的影響。

2.4.3Transwell法檢測細胞的遷移和侵襲能力 細胞遷移實驗中，取CAFs以每孔3.6×104個種植于Transwell 24孔板，設置3個復孔，培養24 h后，取CAFs共培養L、M、H組的MGC-803細胞，以每孔6×104個種植于Transwell小室共培養48 h。預冷甲醇固定，0.1%結晶紫染色并拍照。NFs共培養組同上。

細胞侵襲實驗中，以1 ∶8稀釋Matrigel基質膠，膠凝后，CAFs以每孔3.6×104個種植于24孔板，設置3個復孔，培養24 h后，取CAFs共培養L、M、H組的MGC-803細胞，以每孔1.2×105個種植于Transwell小室共培養48 h。預冷甲醇固定，0.1%結晶紫染色并拍照。NFs共培養組同上。

2.5 AMD3100對CAFs-胃癌細胞共培養體系的影響取CAFs以每孔1.6×105個種植于Transwell 6孔板，24 h后調整MGC-803細胞密度分別為L組、M組、H組，以每孔1.5 mL種植于Transwell小室共培養24 h后，加入AMD3100(10 mg·L-1)至小室繼續刺激24 h，并設置空白對照(C組)。分別取上述MGC-803細胞，以每孔4×103個接種于96孔板，設5個復孔及空白組，分別培養48、72 h后，MTT法測定各孔吸光度值。

2.6 成纖維細胞對不同比例胃癌細胞影響的初步機制

2.6.1pH計測定腫瘤微環境酸化情況 取CAFs以每孔1.6×105個種植于Transwell 6孔板，24 h后調整MGC-803細胞密度分別為L組、M組、H組，以每孔1.5 mL種植于Transwell小室共培養，分別于24、48 h取共培養體系上清液測定pH值。

2.6.2乳酸酶法檢測細胞分泌乳酸情況 分別取上述共培養體系24、48 h細胞培養液，離心取上清液，根據試劑盒說明操作，于530 nm處測定吸光度值，并計算乳酸含量。

2.6.3DCFH-DA法檢測CAFs中ROS水平 取上述共培養后CAFs，根據試劑盒說明操作，以10 μmol·L-1DCFH-DA孵育30 min，于激發波長488 nm，發射波長525 nm處測定吸光度值。

3 結果

3.1 CAFs、NFs的分離純化組織塊接種7 d后，可見CAFs、NFs逐漸沿組織塊邊緣呈放射狀生長，形態呈長梭形、扁平星形、多角形等，CAFs細胞生長速度較快，14 d左右狀態良好，NFs生長速度較慢，21 d左右狀態良好。細胞消化傳代后移入培養瓶，培養至第3代時得到純化的成纖維樣細胞，鏡檢未見上皮樣細胞。

3.2 CAFs、NFs的鑒定

3.2.1形態學特征 如Fig 1所示，CAFs、NFs形態、大小無明顯差異，通常含1～3個核，呈梭形、多角形、不規則形等，可隨細胞間連接方式的變化而改變。相比NFs，CAFs生長速度較快，重疊生長現象更明顯。CAFs、NFs在3～6代時活力旺盛，形態呈梭形，7代以后逐漸出現胞體偏肥大現象，但繼續培養，胞體變小，呈長梭形緊密排列，細胞群呈柵欄狀、放射狀、旋渦狀等。17、18代時，細胞活力減弱，不易呈梭形，并出現胞體肥大、光亮度下降、大量顆粒物質、空泡等老化現象。

Fig 1 Isolation, purification and overlapping growth of human CAFs, NFs cells(×100)

A: CAFs and NFs cells grew radially along the margin of tissue mass; B: CAFs and NFs cells(the fourth generation) were vigorous and mostly in the shape of long spindle; C: Both CAFs and NFs cells appeared overlapping growth phenomenon(circled in red box), but the phenomenon of CAFs cells was more obvious.

3.2.2α-SMA、Vimentin的表達 如Fig 2A、B、C所示，通過免疫熒光法、qPCR、Western blot測定，CAFs高表達α-SMA和Vimentin，而NFs呈低表達或陰性(P<0.01)。經鑒定，CAFs高表達癌相關成纖維細胞激活標志物α-SMA和成纖維細胞標記物Vimentin，NFs保留了Vimentin的表達，分離純化成功，原代培養細胞為人胃癌相關成纖維細胞(CAFs)和正常成纖維細胞(NFs)，為后期研究提供可靠的細胞模型。

3.3 CAFs、NFs的生長曲線如Fig 2D所示，分離純化的CAFs、NFs生長狀態良好，純化和培養條件較為適合，CAFs增殖能力和細胞活性均強于NFs。

3.4 成纖維細胞對不同比例胃癌細胞的影響如Fig 3所示，CAFs共培養組MGC-803細胞活力L組>M組>H組，NFs共培養組L、M組相近>H組，僅有CAFs低密度共培養組MGC-803細胞活力明顯高于未共培養組，遷移、侵襲結果與48 h處吸光度結果保持一致。表明胃癌細胞與成纖維細胞CAFs、NFs共培養受比例影響較大，在一定空間內，隨胃癌細胞比重的增加，共培養體系可能會反過來抑制腫瘤細胞的增長和轉移。同時，空白對照組、L、M、H組的MGC-803細胞吸光度值差異無顯著性，證明此共培養體系選用的接種密度不影響胃癌細胞活性。

Fig 3 Proliferation, migration and invasion of co-cultured MGC-803 cells(×100)

CAFs共培養組促癌增長與轉移能力強于NFs組，腫瘤細胞離開共培養體系后，CAFs促癌增殖能力逐漸減弱，趨向于未共培養組，如Fig 3C所示(72 h)。但NFs在一定程度上也可促進腫瘤細胞的增殖和轉移，可能與腫瘤細胞誘導NFs分化為CAFs的過程及成纖維細胞的高度異質性有關。

3.5 AMD3100對CAFs-胃癌細胞Transwell共培養體系的影響如Fig 3C所示，AMD3100-CAFs-胃癌細胞共培養組與常規CAFs-胃癌細胞共培養組吸光度值差異均有顯著性。在低密度組、空白組共培養體系中，AMD3100均可抑制胃癌細胞的增長，離開共培養體系后，其抑癌增殖能力逐漸減弱。但隨著胃癌細胞比重增加，AMD3100可能會減弱CAFs高密度共培養體系的抑癌效果。

3.6 CAFs-胃癌細胞Transwell共培養體系酸化情況如Fig 4A所示，與空白組相比，CAFs共培養體系pH值降低，表明CAFs為胃癌營造出“高酸性”的腫瘤微環境，并隨共培養時間延長而酸性增強。其中，高密度共培養組CAFs層pH值明顯低于低、中密度共培養組，而胃癌層并無明顯現象。

3.7 CAFs-胃癌細胞Transwell共培養體系乳酸及ROS含量如Fig 4B、4C所示，在共培養體系胃癌層中，低密度共培養組乳酸含量低于空白組，而高密度共培養組高于空白組，并隨共培養時間延長乳酸含量降低。在共培養體系CAFs層，乳酸、ROS含量均高于空白組，且隨著胃癌密度增大而增加。

4 討論

腫瘤異質性是惡性腫瘤的特征之一，可使腫瘤的生長轉移、藥物敏感性、預后等方面產生差異[5]，主要體現在腫瘤細胞本身結構特點、行為差異性，以及微環境隨腫瘤發展的動態變化。研究顯示，CAFs和NFs不僅可以促進腫瘤的發生、發展，也可抑制腫瘤的生長[6-7]，同時NFs也可表達α-SMA等癌相關成纖維細胞標志物[8]，推翻了以往對成纖維細胞的認知，但具體發生機制尚未闡明。AMD3100是CXCR4的特異性小分子拮抗劑，普遍認為通過阻斷SDF-1/CXCR4等信號通路，抑制胃癌細胞的生長與轉移[9]。但2018年Berning等[10]發現，AMD3100可促進尤文肉瘤細胞的增殖，并激活受體酪氨酸激酶信號傳導，但目前胃癌研究中尚未發現相關報道。CAFs在形態、來源和功能等方面均體現出高度異質性，近幾年來，此異質性作用逐漸得到國外學者重視，然而國內報道寥寥無幾，值得進一步關注。

本實驗通過對人CAFs、NFs的生物學分析，發現CAFs、NFs的形態、大小無明顯差異，可能與CAFs來源于靜息狀態成纖維細胞(NFs)有關。篩選出較為適宜探究CAFs促癌功效的共培養體系，發現CAFs、NFs對腫瘤細胞的促進和抑制作用受共培養比例影響較大，低密度CAFs-腫瘤細胞共培養體系更能明顯提高胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力，高密度共培養體系可能會抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，并通過3種不同比例共培養，最大程度表現出腫瘤微環境的異質性效果。首次發現CAFs-AMD3100可明顯抑制低密度胃癌細胞活性，而促進中高密度胃癌細胞增長，表明腫瘤異質性在CAFs細胞及其SDF-1/CXCR4通路均有體現，為后期探究腫瘤微環境對腫瘤細胞的促進或抑制作用、AMD3100對腫瘤胞的異質性影響提供實驗參考與思路。

Pavlides等[11]提出一種新的能量傳遞機制“反Warburg效應”，即腫瘤細胞分泌過氧化氫，有針對性觸發CAFs的氧化應激，導致CAFs線粒體吞噬，產生更多ROS，誘發連鎖反應，并通過糖酵解方式產生乳酸、酮等高能量線粒體原料[12]，促進癌細胞獲得混合糖酵解/OXPHOS表型，以提高代謝可塑性并提供能量[13]。研究發現，胃腸道腫瘤患者體內氧化應激水平升高，少量ROS可促進腫瘤細胞產生，但過高濃度ROS可導致胃癌細胞凋亡。本實驗通過不同比例共培養刺激CAFs的“反Warburg效應”，發現低密度共培養組分泌少量的乳酸和ROS，并具有促癌效果，而高密度共培養組酸度過低，乳酸、ROS過高可能與抑制腫瘤細胞活力有關。此模型的建立，有助于利用腫瘤微環境的正反Warburg效應，對腫瘤代謝依賴性和耐藥性作用機制進行深入探究。

腫瘤生長轉移是一個多因素、多步驟的協同演變過程，受腫瘤微環境及眾多細胞因子相互影響，具體機制尚未明確。CAFs可以促進腫瘤細胞增殖、轉移和侵襲，且基因組相對穩定，不易耐藥。積極探索CAFs與NFs差異性及與腫瘤細胞的相互作用，對從腫瘤微環境多方向、多靶點治療胃癌有重要意義，為腫瘤的綜合治療和抗腫瘤轉移提供了實驗依據，也為多組份、多靶點的中醫藥防治腫瘤術后轉移提供了可能和新的研究方向。

(致謝:本實驗在江蘇省中醫藥研究院中藥藥理毒理實驗室完成，非常感謝本課題組全體老師和同學的指導和幫助。)