實時熒光PCR的探針熔解曲線分析與質譜分析應用于耳聾基因診斷的對比研究

王格

(珠海市婦幼保健院 廣東 珠海 519000）

先天性耳聾是由多種環境和/或遺傳因素共同作用導致，也可由單一基因或不同基因的復合突變所導致，在新生兒期的發病率約為1‰～1.86‰[1]。目前針對基因檢測的方法主要有質譜分析技術（MALDI-TOF-MS）[6]、基因測序技術[2]、反向點雜交技術和熔解曲線技術。實時熒光檢測技術的探針熔解曲線分析法(Probe melting curve analysis，PMCA)，臨床應用日趨廣泛，能夠在一次擴增之后通過檢測PCR產物多色熒光熔解曲線就可鑒定多種突變。本研究以DNA測序技術為金標準，比較PMCA和質譜技術檢測突變耳聾基因的性能，評價其作為常規檢測耳聾基因技術的可行性。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月－4月在珠海市婦幼保健院出生，經MALDITOF-MS技術診斷為耳聾基因攜帶者的嬰兒臍帶血標本92份和正常標本4份，本研究得到珠海市婦幼保健院倫理委員會批準，受檢者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 上述臍帶血標本均采用乙二胺四乙酸三鉀(EDTA—K2)抗凝，采用致善快速DNA提取儀抽提人類白細胞基因組DNA，采用紫外分光儀于260、280 nm處測定吸光度(A)值，以鑒定所抽提DNA的質量并計算其濃度，保證所抽提的DNA符合質量要求，使用時稀釋至20 ng/ul。

1.2.2 耳聾基因的檢測 PCR的探針熔解曲線分析試劑盒由廈門致善生物技術有限公司生產。檢測位點包括中國人群常見4個耳聾基因的20種基因突變，分別為GJB2：c.35delG，c.167delT，c.176-191del16bP，c.235delC，c.299-300delAT；GJB3：c.538C＞T，c.547G＞A；mtDNA：m.1494C＞T，m.1555A＞G；SLC26A4：c.749T＞C；c.754T＞C，c.919-2A＞G，c.1174A＞T，c.1226G＞A，c.1229C＞T，c.1707+5G＞A，c.1975G＞C，c.2017T＞A，c.2162C＞T，c.2168A＞G。20種突變分為A、B、C、D四管進行。檢測過程如下：先將泡罩包裝的耳聾檢測PCR 反應管A/B/C/D從試劑盒取出，瞬時離心，然后將預先稀釋好的待測DNA標本25ul直接加到含PCR反應液粉末的A/B/C/D四管中，蓋嚴管蓋后于渦旋振蕩器中充分振蕩混勻20s，短暫離心后，轉移至SLAN-96上進行PCR擴增及熔解曲線分析。然后按照試劑盒說明書對所采集的熒光數據進行結果分析。

1.2.3 檢測結果不一致樣本的測序 檢測結果不一致樣本外送華大基因進行測序分析。

2.結果

2.1 耳聾基因檢測方法的比較

96例患者經兩種方法進行耳聾基因的檢測，其中94例檢測結果相同，分別為90例具有耳聾基因突變的患者和4例無耳聾基因突變患者。2例患者耳聾基因檢測結果不同。具體見表。

表 96例患者耳聾基因檢測結果

2.2 兩種檢測方法差異樣本的分析

對2例檢測結果不同的樣本進行了測序分析，發現都具有SLC26A4：281C＞T的突變，而熔解曲線法檢測的耳聾基因沒有包括該位點。

3.討論

我國新生兒聽力篩查陽性率為1‰，而14歲以下兒童的耳聾患病率約為3.5‰，其中每年約有2.4萬遺傳性耳聾兒童不能通過新生兒聽力篩查檢測出來[2]。MALDI-TOF-MS作為常用的新生兒耳聾基因的篩查方法，具有高通量優點，但高昂的設備和試劑費用以及適合大批量檢測，嚴重限制了該技術的普及，基本都是外送第三方檢測公司，時效性不足。熔解曲線法具有簡單快速的特點，而且對設備與場地要求相對較低，醫療機構的分子生物學實驗室即可開展，具有巨大的應用潛力。

我們選取了2017年1月－4月96例樣本，其中90例經MALDI-TOF-MS檢測為陽性，采用熔解曲線法進行檢測，結果顯示突變位點相同。4例樣本經MALDI-TOF-MS檢測為陰性，熔解曲線法檢測也為陰性。有2例樣本MALDI-TOF-MS檢測為陽性，熔解曲線法檢測為陰性，將該樣本進行測序分析，發現兩例皆存在SLC26A4：281C＞T位點的雜合突變，而熔解曲線法耳聾基因檢測沒有包括該位點。兩種檢測方法只有兩個耳聾基因檢測位點不同，都位于SLC26A4區域，MALDI-TOF-MS為281C＞T,589G＞A,熔解曲線法為749T＞C,754T＞C，國內對新生兒281C＞T,589G＞A位點的突變進行了一定的篩查，藍培基[3]對廣東省韶關市328例新生兒進行耳聾基因檢測，沒有發現281和589位點的基因突變，李振安[4]對40672例佛山市新生兒進行耳聾基因篩查，發現281C＞T,589G＞A雜合突變各2例。唐燕青[5]對21386例廣西新生兒進行耳聾基因篩查，發現589G＞A雜合突變2例，281C＞T雜合突變1例。在前期研究中，我們對珠海9775例新生兒進行耳聾篩查，發現了2例589G＞A雜合突變，沒有存在281C＞T的突變[6]。PU Dai[7]等人在205例非綜合征型感音神經性聽力受損而顳骨無異常患兒中檢測出一例749T＞C突變,H-J Parkde[8]等人在86例耳聾患兒在檢測出1例754T＞C的突變。檢測結果顯示在新生兒耳聾基因檢測方面上述兩種方法具有良好的一致性。但該研究還存在著以下幾個方面的不足：（1）陰性樣本數量不足；（2）兩種檢查方法中4個耳聾基因18個相同的熱點突變位點只評估了13個；（3）需進行多重突變的評估。

綜上所述，熔解曲線法與MALDI-TOF-MS在檢測新生兒耳聾基因方面具有良好的一致性，可以替代MALDI-TOF-MS，值得在臨床推廣應用，可以促進遺傳性耳聾患者的早發現、早診斷、早干預，對該病的防控，提高出生人口素質具有重要的意義。