溫度和時間對臨床應用間充質干細胞長距離運輸的影響

蘇鴻君，鄧雯，馮佩，蘇春燕，楊潔文

（中山大學孫逸仙紀念醫院 生物治療中心，廣東 廣州 510120）

0 引言

間充質干細胞是一種具有多向分化潛能和免疫調節能力的成體干細胞，源于發育早期的中胚層和外胚層，存在于人體發育過程的多種組織，主要存在于結締組織和器官間質中。1976 年，Freidenstein首次發現在骨髓里存在一群不純的細胞，這群細胞在體外培養時貼壁生長，形態和成纖維細胞類似，呈克隆性生長，并提出了“骨髓間充質干細胞”的概念[1]。根據間充質干細胞的生物學特性，目前已建立了骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織來源的間充質干細胞的分離、培養、擴增和鑒定的實驗方法，其中以骨髓組織中含量最為豐富。間充質干細胞不僅具有強大的增殖能力，同時也具有多向分化潛能。在適宜的體內或體外環境下，MSC 不僅可分化為造血細胞，還具有分化為肌細胞、肝細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、基質細胞等多種細胞的潛能[2]。MSC 可以用于細胞療法治療骨骼和心血管缺陷以及其他各種退化性疾病和組織損傷[3]，MSC 也可以調節免疫和炎癥反應用于各種臨床試驗比如移植物宿主免疫反應和其他自身免疫性疾病[4]。

人類間充質干細胞體外擴增至10 代，細胞形態不發生明顯改變，并高表達間質細胞標記CD73、CD90、CD105，不表達造血細胞標記CD34、CD45、CD14。Cai 等發現體外擴增第1 代至第8 代期間MSC 生長速度很快，以指數形式快速增值，且MSC基因組沒有顯著的改變，僅有一些很低水平的單核苷酸的變化（single-nucleotide change，SNC），僅占0.1 %-1 %；第8 代以后，擴增速度明顯降低。第10代到第13代，細胞體積開始增大，核/質比變大，但是細胞的分化潛能從第1 到第13 代幾乎沒有變化。但是在第13 代的時候，顯著地出現了677 個單核苷酸的突變，17 %-36 %的MSC 出現了突變。而且這些突變導致了非同義氨基酸的突變，引發了一些基因（如NOTCH1、ZFP64、SMARCA2、KIAA2018、DCAF8L1 等）的突變。而且他們發現這些基因與成骨分化、骨代謝、腫瘤發生、干細胞干性的保持等功能相關[5]。說明MSC 在體外擴增的過程中，如果代數超過12 代，就會引起MSC 產生癌變的風險。體外擴增的MSC在臨床應用上的應用最好限制在12代以內。

但是能制備間充質干細胞的醫療機構必須具備GMP 合格的千級細胞層流房，這樣的醫療機構畢竟是少數，所以臨床上間充質干細胞的廣泛應用必須解決一個遠距離運輸的問題。一般制備成功的間充質干細胞長途外送過程中會遇到以下問題：（1）液氮凍存的細胞外送：不能上飛機、高鐵，若選擇汽車，運輸時間超過12 小時以上液氮會完全揮發，凍存的細胞會升溫死亡；（2）新鮮培養液加至滿瓶后置于冰盒中外送：上飛機須托運，總時間長于5 小時，細胞培養液PH 值會升高，影響細胞狀態，細胞形態會發生變化，影響細胞分化潛能和免疫調節能力，而且細胞受污染的風險會升高；（3）貼壁細胞用胰酶消化清洗后注射入生理鹽水瓶中懸浮密封低溫外送：即使隨著時間延長，細胞存活率會降低。生理鹽水外送的細胞可以直接注射，可以解決一些地區不具備復蘇細胞和處理貼壁細胞的條件的問題，而且密封性好污染風險低。但是最佳的外送溫度和時間限制的條件不明確，本實驗設計以骨髓間充質干細胞為例，測量不同溫度和時間對細胞存活率的影響[6]。

1 方法

1.1 人骨髓間充質干細胞的制備

髂后上棘抽取骨髓10-15 mL，加入等體積生理鹽水混勻。在15 mL 離心管中加入與骨髓等體積的淋巴細胞分離液，將稀釋的骨髓緩慢加入淋巴分離液液面上，水平離心機常溫下以1500 r/min 的速度離心20 分鐘。從界面上取出的白色的細胞層后用生理鹽水洗滌2～3 次后，加適量培養液計數。按5～8×106/mL 濃度接種于25 cm2培養瓶中，每瓶含16 mL L-DMEM 完全培養液。在5 %的CO2和37 ℃的培養箱中靜止培養，第3 天半量換液1 次，第6 天全換液，以后每3 天半量換液1 次，第10～12 天細胞達到90 %融合時傳代。傳代時先倒掉全部培養液，用無Ca2+、Mg2+的PBS 緩沖液洗滌二次，加入37 ℃預熱的0.25%胰蛋白酶（含1 mmol/L EDTA）0.5 mL消化2～5 分鐘，貼壁細胞層開始脫落時，加入完全培養液5mL 終止胰酶作用。吸管反復吹打后將細胞收集于15 mL 離心管中，1500 r/min 離心10 分鐘后棄上清，將細胞懸浮于完全培養液中，計數后按1～2×106/瓶的密度接種于新的75 cm2培養瓶中。繼續按1 比2 或1 比3 的比例傳至3～4 代，即可得到純化的人骨髓MSC，并用流式細胞儀進行鑒定。

1.2 人骨髓間充質干細胞的鑒定

將第4 代的MSC 用胰酶消化后，用完全培養液終止后，離心洗滌2 次，用生理鹽水重懸細胞濃度至1×106/mL。每一個需要檢測的細胞表面標記抗原設置2 支流式管，每一支流式管加入100 ul 的細胞懸液，再分別加入1 test 的同型對照抗體和對應的細胞表面標志抗原流式熒光抗體。人骨髓MSC 需要檢測CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLADR 等7 個細胞表面標記抗原的表達情況。同時，將每一個MSC 取3×105，種入12 孔板三個孔中，每孔加入1×105，分別加入成骨誘導分化培養基、成脂誘導分化培養基和成軟骨誘導分化培養基，進行MSC分化能力鑒定。

1.3 存活率的測定

第4 代的MSC 用胰酶消化并終止后，離心洗滌4次，用生理鹽水重懸至預估濃度范圍為0.1-10×106/mL，吸取5 ul 細胞懸液和5 ul 臺盼藍染色液，混合均勻后加入細胞計數板，進行活細胞計數。

2 結果

2.1 人骨髓間充質干細胞的制備

淋巴細胞分離液分離后的骨髓細胞在37 ℃的5%CO2細胞培養箱中靜止培養后第6-9 天，出現細胞克隆集落（圖1），繼續培養至10-12 天后可傳代，培養30-35 天后傳代至第4 代，可以得到較為純凈的人骨髓MSC（圖2）。

圖1 人骨髓MSC P0 代細胞

2.2 人骨髓間充質干細胞的鑒定

將6 個MSC 的第4 代細胞進行細胞表面標記抗原流式鑒定，所有細胞CD73,CD90 和CD105 陽性表達達到95 %以上，CD14,CD34,CD45,HLA-DR 皆幾乎不表達，表達率在0-1 %，圖3 所示為其中一個MSC細胞表面標記抗原的表達情況。6 個細胞皆可以進行成骨、成脂和成軟骨分化，圖4 中a，b 和c 分別顯示成骨、成脂和成軟骨分化陽性的圖示。

圖3 人骨髓MSC 細胞表面標記抗原表達情況

圖4 人骨髓MSC 成骨、成脂和成軟骨分化鑒定

2.3 時間溫度對生理鹽水中骨髓間充質干細胞的影響

將6 個4 代的人MSC 分別分成5 份裝入100 mL密封生理鹽水袋中，分別放入盛冰水混合物的保溫盒（0 ℃）、4 ℃恒溫車載小型冰箱、裝有預先冷凍冰袋的保溫盒（8-17 ℃）、常溫保溫盒（25 ℃左右）和37 ℃恒溫培養箱（對照）。將上述30 份細胞分別在6 個時間點（0 h,2 h,4 h,6 h,8 h 和24 h）用無菌1 mL 注射器抽取少量細胞進行存活率檢測。發現只有4 ℃恒溫保存的細胞保持存活率在90 %上的時間最長，可以達到6 小時，其次是放入裝有預先冷凍冰袋的保溫盒（8-17 ℃）的細胞，可以達到2 小時（表1）。繪制成折線圖后發現4 ℃恒溫保存的方法細胞存活率在每個時間點都最高（圖5）。

圖5 時間和溫度對人骨髓MSC 存活率的影響

表1 6 個骨髓間充質干細胞(第4 代)制備后重懸于生理鹽水中后時間和溫度對存活率的影響

3 討論

隨著干細胞產業的飛速發展，干細胞進行遠途運輸勢必會越來越頻繁。本實驗中發現在4 ℃的恒溫保溫箱中保持細胞良好活性（存活率90 %以上）的時間最長，可以達到6 小時。隨著高鐵、飛機等快捷交通工具的應用，這個保存條件基本可以滿足干細胞遠距離運輸的要求。而且隨著干細胞多中心的建立，跨省的干細胞運輸會越來越少，遠距離運輸的距離會越來越短，所需時間也會越來越短。從圖5，我們可以看出細胞在缺失營養的條件下，溫度越低細胞活性越好，這可能與低溫條件下細胞的代謝速率降低有關[7-10]。4 ℃恒溫條件下細胞活性最好的原因，可能與水在4 ℃時密度最大有關。而處于冰水混合物條件（0 ℃）下細胞的存活率比8-17 ℃還低，可能是因為水雖然在0 ℃時結冰，但水在0 ℃以下，也可以保持液體狀態，稱為過冷卻水，冰水混合物中的液態水中存在溫度低于0 ℃的過冷卻水。冰水混合物條件下的部分細胞溫度可能低于0 ℃，細胞內部產生了結晶，在沒有細胞保護液的條件下，細胞會受到傷害，細胞活性就會降低。而且0 ℃的條件也很難保持，時間長看冰水混合物中冰會融化，而將溫度調節至0 ℃的小型冰箱也容易結冰。因此，4 ℃才是活細胞運輸的最佳溫度條件。隨著技術的進步，如果出現一種安全無害且可以直接輸注人體的懸浮細胞營養保存液，保存時間將遠遠超過6 小時。