燈盞花素對肝臟缺血再灌注損傷大鼠肝臟和腸黏膜屏障功能的保護作用*

林秋香，王雪雯，黃祖雄，潘 晨

缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指組織在一定時間內缺血，恢復供血后組織受到損傷加重的現象[1]。在大多數情況下，動物器官缺血后再灌注可以使得組織器官功能得到恢復，受到損傷的結構也得到恢復，但肝臟缺血一段時間后重新恢復血流會發生損傷進一步加重的現象。研究表明能量代謝障礙、氧自由基的產生、細胞內鈣超載、中性粒細胞活化并釋放炎性細胞因子等均為影響IRI程度的重要因素[2]。燈盞花素（erigeron breviscapus）又名燈盞細辛，主要有效成分為黃酮類[3，4]。經過成分鑒定，燈盞花素中的燈盞乙素含量約為95%，主要從短亭飛蓬中提取而來。有研究表明，燈盞花素可以有效減少血小板凝聚、改善心腦血管血流量、抵抗自由基的氧化作用[5，6]。燈盞花素可以有效地保護肝臟，其主要機理為其能清除氧自由基、降低血漿纖維蛋白原含量和促進纖溶酶活性，改善微循環。燈盞花素對腸IRI有明顯的保護作用，主要是其能改善腸粘膜微循環障礙，從而能保護腸黏膜屏障功能[7，8]。本研究觀察了燈盞花素對大鼠肝臟IRI和腸黏膜屏障功能的保護作用，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級6周齡雌性大鼠45只，體質量為200±30 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號為SCXK（京）2017-0022，普通級，分9籠飼養于本院動物中心實驗室。總一氧化氮（NO）檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 肝臟缺血再灌注損傷模型的制備[9]隨機將大鼠分為對照組、模型組和燈盞花素干預組，每組15只。術前3 d，給予模型組和對照組動物生理鹽水5 ml·kg-1經尾靜脈注射，在燈盞花素干預組，給予燈盞花素5 mg.·kg-1尾靜脈推注。給予模型組和燈盞花素處理組大鼠3%戊巴比妥鈉30 mg·kg-1腹腔注射麻醉，正中切口進腹，解剖肝門，用無創動脈夾夾閉肝臟左、中葉門靜脈和肝動脈分支，制造約70%肝臟缺血模型。60 min后，松開動脈夾，進行再灌注120 min；在對照組，以相同的手術方法切開顯露門靜脈和肝動脈，但不夾閉血管。參照前期研究，制備腸I/R模型[10]。在模型組大鼠和燈盞花素干預組，給予10%水合氯醛溶液3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉，手術、分離腸系膜上動脈（SMA），使用微動脈夾，造成腸缺血模型，45 min后松開動脈夾，進行再灌注 60 min。

1.3 血漿內毒素檢測 取大鼠血漿100μL，嚴格按照ELISA試劑盒（美國Sigma公司）說明書操作步驟檢測。

1.4 大鼠腸黏膜分泌型（S）IgA及腸組織誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）、NO、TNF-α和IL-1β水平檢測 刮取腸黏膜，溶于PBS（pH 7.4）2 mL中制成懸液，采用ELISA 法（購自美國R&D Systems公司）檢測SIgA水平。取大鼠腸組織，溶于PBS（pH 7.4）2 mL中制成懸液，采用ELISA檢測NOS（上海仁捷生物科技有限公司）、NO（上海齊一生物科技有限公司）、TNF-α和IL-1β（武漢華聯科有限公司）。

1.5 腸黏膜屏障功能檢測 取大鼠靜脈血2μL，2000 r/m離心后，吸收上層血清，采用化學發光法檢測血清降鈣素原（PCT）水平（試劑盒購自武漢佰奧達生物科技有限公司）；采用活性比色法檢測血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）水平（ 試劑盒購自廈門慧嘉生物科技有限公司）。

1.6 大鼠肝組織Toll樣受體-4（TLR4）和核因子（NF）-κB表達水平檢測 采用Western blot法，以β-actin為內參，應用Imagaquent 5.1軟件對蛋白質條帶灰度進行相對定量分析。以TLR4和NF-κB蛋白條帶與 β-actin灰度比值表示蛋白相對表達水平。

1.7 統計學方法 應用SPSS 22.0軟件處理和分析，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠腸粘膜SIgA和血漿指標比較 與對照組比，模型組大鼠腸黏膜SIgA含量顯著下降（P＜0.01）；大鼠血漿內毒素、PTC和DAO水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比，燈盞花素干預組大鼠SIgA含量顯著升高，而內毒素、PTC和DAO水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01，表1）。

表1 大鼠腸粘膜SIgA、血漿內毒素、PTC和DAO水平（±s）比較

表1 大鼠腸粘膜SIgA、血漿內毒素、PTC和DAO水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

DAO（Ku/L）對照組 0.7±0.1 0.2±0.1 3.5±0.98 6.5±1.2模型組 0.2±0.1① 0.8±0.1① 5.0±1.2① 10.5±1.6①燈盞花素 0.7±0.1② 0.3±0.1② 3.9±1.0② 7.5±1.3②SIgA（μg/kg）內毒素（EU/ml）PTC（ng/ml）

2.2 大鼠腸組織iNOS、eNOS和NO水平比較 與對照組比，模型組大鼠腸組織iNOS含量顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.01），而eNOS和和總NO含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比，燈盞花素干預組大鼠腸組織iNOS含量顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.01），而eNOS和總NO含量顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.01，表2）。

2.3 大鼠肝組織TLR4和NF-κB及血漿TNF-α和IL-1β水平比較 與對照組比，模型組大鼠肝組織 TLR4和 NF-κB及血漿 TNF-α 和 IL-1β水平顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比，燈盞花素處理組大鼠肝組織 TLR4和NF-κB及血漿TNF-α和IL-1β水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01，表3）。

表2 大鼠腸組織iNOS、eNOS 和NO 水平（±s）比較

表2 大鼠腸組織iNOS、eNOS 和NO 水平（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

iNOS（U/g） eNOS（U/g） NO（μmol/g）對照組 0.2±0.1 0.4±0.1 0.4±0.0模型組 0.7±0.1① 0.2±0.1① 0.2±0.1①燈盞花素 0.3±0.1② 0.8±0.2② 0.8±0.1②

表3 大鼠肝臟組織TLR4、NF-κB及血漿TNF-α和 IL-1β（±s）比較

表3 大鼠肝臟組織TLR4、NF-κB及血漿TNF-α和 IL-1β（±s）比較

與對照組比，①P＜0.01；與模型組比，②P＜0.01

IL-1β（mg/g）對照組 0.3±0.1 0.5±0.1 10.2±1.2 0.5±0.1模型組 1.3±0.2① 1.3±0.2① 15.5±1.1① 1.3±0.1①燈盞花素 0.3±0.1② 0.7±0.1② 11.8±0.2② 0.6±0.1②TLR4 NF-κB TNF-α（pg/ml）

3 討論

由于肝臟缺血再灌注后肝功能反復出現異常，會使得腸道系統存在慢性炎癥反應，導致腸黏膜屏障保護功能受到嚴重影響，滲透性程度明顯增加，阻隔內毒素的功能顯著性降低。當腸道內毒素水平過高會導致內毒素血癥，進一步加重肝功能損害和腸黏膜屏障功能紊亂的嚴重程度[11]。本研究發現使用燈盞花素處理后大鼠血漿內毒素水平顯著降低，說明燈盞花素可以有效緩解大鼠腸道損傷。有研究表明[12，13]，eNOS催化產生的NO對腸黏膜屏障功能有保護作用，缺血再灌注損傷會促使炎癥反應，誘導iNOS表達增加，導致NO合成增加，在這種情況下iNOS催化產生的NO被認為對腸黏膜屏障功能有損傷作用。有研究發現[14-16]，腸黏膜屏障功能損傷后，大量NO與超氧化物自由基反應產生過氧亞硝酸鹽，并發生亞硝化反應，促使NO含量增加，加重缺血再灌注對腸黏膜屏障功能的損害。燈盞花素處理可激活eNOS/NO通路、增加腸黏膜SIgA表達、使得大鼠血漿內毒素含量減少，減輕腸黏膜損傷[17]。本研究發現在使用燈盞花素處理后，大鼠腸黏膜SIgA和體內內毒素顯著降低，說明燈盞花素有效地改善了腸黏膜屏障功能。大鼠體內eNOS/NO含量也顯著上升，說明燈盞花素有效地激活了eNOS/NO通路，達到對腸黏膜屏障功能的保護作用，這與先前的研究結論相一致。

PCT是無生理學活性功能的降鈣素前肽。當腸黏膜屏障保護系統受到嚴重損害時會促進內毒素的分泌和釋放，這些內毒素會導致 PCT合成分泌量迅速升高，使得血清 PCT平顯著性升高。血漿PCT水平可準確反映腸黏膜屏障功能損傷的嚴重程度[18]。DAO則是一種腸黏膜上皮細胞內酶，腸黏膜上皮受到嚴重損害時，會分泌DAO并釋放入腸間隙和血液循環系統，導致血漿DAO水平顯著升高，故DAO水平可準確反映腸黏膜組織結構和生理功能狀態[19]。本研究發現使用燈盞花素處理后，大鼠血漿PCT和DAO水平顯著降低。

NF-κB是一種真核轉錄因子，其作用和分布都十分廣泛，有研究表明其參與各種炎癥反應和免疫調控[20]。在肝臟缺血再灌注過程中NF-κB調控的炎癥因子有TNF-α、IL-1β、IL-1和IL-6等。燈盞花素預處理可以通過抑制NF-κB的表達，下調炎癥因子分泌，達到緩解肝臟IRI的加重。TLRs是近年發現的一類模式識別受體（pattern recognition receptor），主要有 TLR1-TL9，其中 TLR-4 主要存在于肝臟細胞，是一種跨膜蛋白。有研究表明，TLR-4含量的增加會使IRAK4磷酸化，激活TRAF6，導致NF-κB活化，促使 TNF-α、IL-1β、IL-1和 IL-6表達，加重肝臟IRI。本實驗發現，在使用燈盞花素處理的大鼠，體內NF-κB顯著下降，相應的炎癥因子含量也顯著下降，有效地緩解了大鼠肝臟IRI。本實驗還發現燈盞花素處理組大鼠體內TNF-α和IL-1β含量顯著下降，這一結果也證明了藥物處理大鼠體內NF-κB和TLR-4含量確實下降了，因而肝臟缺血再灌注損傷也得到了顯著的改善。