七氟醚對膿毒癥大鼠肝損傷的保護作用及其作用機制研究*

石小龍，杜 睿，秦革萍，薛華燕，張宏鑫

膿毒癥是機體出現重大損傷感染后出現的一系列復雜的臨床病癥，是重癥監護病房（ICU）常遇到的疾病[1]。隨著膿毒癥病情的發展，機體各個臟器會受到不同程度的損傷，肝臟是膿毒癥最容易損傷的器官。如果肝功能不全患者發生膿毒癥會進一步發展為多臟器功能衰竭，威脅患者生命[2]。目前，對膿毒血癥發病機制的研究還在繼續。新型吸入麻醉藥七氟醚，化學名為氟甲基-六氟-異丙基醚，已被廣泛應用于手術麻醉。有報道稱，應用七氟醚預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷有保護作用，但是七氟醚對膿毒癥的影響卻鮮見報道[3-5]。本研究制備膿毒癥肝損傷大鼠模型，探討了七氟醚對膿毒癥肝損傷大鼠肝功能的影響，為臨床廣泛應用七氟醚麻醉提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器 60只SPF級健康雄性成年SD大鼠，體質量為220±30 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。檢測血清ALT、AST、TBIL試劑盒購自南京建成生物工程研究所，抗-actin抗體、抗淋巴細胞功能相關抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）和抗巨噬細胞1抗原（macrophage-1 antigen，Mac-1）抗體（Abcam）。BCA蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime Biotechnology）。多功能酶標儀（Thermo Scientific MultiSkan Go），電泳儀電源（Tanon），相差顯微鏡（Leica）。

1.2 膿毒癥大鼠模型制備 將60只SD大鼠隨機分為假手術組、膿毒癥組和七氟醚組。假手術組大鼠只進行開關腹縫合手術；在膿毒癥組，采取盲腸結扎穿孔（CLP）法建立膿毒癥動物模型；在七氟醚組，將大鼠置于密閉容器內，一端連接麻醉機，另一端連接麻醉機檢測儀，以3 L/min的速度輸送七氟醚。當儀器顯示七氟醚濃度達到2%后，將大鼠放入并維持30 min，再行CLP法建立膿毒癥動物模型。術前2 h，給予戊巴比妥鈉100 mg·kg-1腹腔注射麻醉，仰臥位固定。頸、腹部備皮，頸部埋針用于輸液，以改良的CLP法制備大鼠膿毒癥模型，其具體的操作步驟為：在下腹部正中位置切開約2 cm的切口，找到盲腸，并結扎盲腸根部，采用自制穿孔針在距盲腸末端1cm處戳孔，孔徑約0.5 cm，擠出糞便，結扎離斷雙側大網膜，采用彎針縫合腹腔。術后，立即皮下注射乳酸鈉林格液50 ml·kg-1調節體液、電解質和酸堿平衡，所有大鼠經靜脈給予營養支持（蛋白質含量為22.4%，脂肪含量為11.8%，碳水化合物含量為65.8%）。建立模型成功的標準：達到動物全身炎性反應綜合征的參照標準[6]，且經組織病理學觀察可見膿毒性肝臟損傷。造模給藥結束后，處死大鼠，取肝組織，行病理學檢查。

1.3 血生化指標檢測 自右側頸外靜脈采血1 ml，3000 r/m離心，取血清，檢測。

1.4 肝組織LFA-1和MAC-1蛋白表達檢測 采用Western blot法，取肝組織，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，低溫離心機4℃、12000 r/m離心10 min，收集上清液并轉移至新的EP管中，采用BCA試劑盒行蛋白定量。取蛋白樣品，用PBS稀釋，加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，自然冷卻。使用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至PVDF膜。配制5%脫脂奶粉，攪拌均勻，封閉PVDF膜1 h，加一抗，4℃過夜。次日，洗去非特異性結合的抗體，加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，用TPBS洗滌3次。采用ECL顯色法，在暗室中加膠片曝光，掃描，應用Image J 2X軟件進行蛋白條帶光密度值分析。

1.5 統計學分析 應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計量資料均服從正態分布，結果以±s表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較先行方差齊性檢驗，對方差齊性的資料采用單因素方差分析，對方差不齊的資料采用Kruskal-Wallis檢驗，當P＜0.05時，表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織病理學表現情況 在光鏡下觀察，發現假手術組大鼠肝小葉結構清晰，肝索排列整齊；膿毒癥組大鼠肝組織可見有明顯的炎性細胞浸潤，肝小葉肝索排列紊亂，肝細胞水腫明顯；七氟醚組肝組織肝索排列較為整齊，炎性細胞浸潤較膿毒癥組大鼠明顯減少，提示七氟醚對大鼠肝損傷有一定的保護作用（圖1）。

圖1 各組大鼠肝組織病理學變化情況（HE，200×）

2.2 各組大鼠血生化指標比較 膿毒癥組動物血清AST、ALT和 TBIL顯著高于假手術組（P＜0.05），而七氟醚組動物血清AST、ALT和TBIL水平較膿毒癥組顯著下降（P＜0.05），提示七氟醚對膿毒癥引起的肝損傷有一定的保護作用（表1）。

表1 各組大鼠血生化指標（±s）比較

表1 各組大鼠血生化指標（±s）比較

與假手術組比，P＜0.05；與膿毒癥組比，P＜0.05

只 AST（U/L） ALT（U/L） TBIL（μmol/L）假手術組 20 67.7±11.7 45.5±9.4 1.7±0.4膿毒癥組 20 156.8±14.7 75.6±7.5 4.5±0.6七氟醚組 20 100.5±7.9 61.5±10.1 3.2±0.5

2.3 各組大鼠肝組織LFA-1和MAC-1蛋白表達情況 經Western blot法檢測大鼠肝組織 LFA-1和MAC-1蛋白表達情況發現，假手術組肝組織LFA-1和MAC-1表達均較少，膿毒癥組LFA-1和MAC-1蛋白明顯增多，而七氟醚組肝組織LFA-1和MAC-1蛋白表達與膿毒癥組比明顯減弱（P＜0.05，圖2，表2），上述結果表明七氟醚通過降低膿毒癥肝損傷大鼠肝組織LFA-1和MAC-1表達，從而對肝損傷起到保護作用。

圖2 各組大鼠LFA-1和MAC-1蛋白表達情況

表2 各組大鼠肝組織 LFA-1和MAC-1蛋白表達（±s）比較

表2 各組大鼠肝組織 LFA-1和MAC-1蛋白表達（±s）比較

與假手術組比，P＜0.05；與膿毒癥組比，P＜0.05

LFA-1 MAC-1假手術組 20 0.2±0.1 0.2±0.1膿毒癥組 20 1.2±0.2 1.0±0.2七氟醚組 20 0.7±0.2 0.6±0.1只

3 討論

膿毒癥主要是機體對感染的反應失調而導致危及生命的全身炎癥反應性疾病。雖然很早就被人們發現，但是其病理過程復雜，所以具體的發病機制仍不清楚。目前主要的治療方法是控制感染源、使用抗生素以及其他的輔助療法，沒有針對性的治療方案[7-9]。七氟醚在臨床上被廣泛使用。有研究報道，七氟醚對心肌細胞有很好的保護作用，能夠明顯降低心臟病的發病率和病死率。七氟醚在神經外科手術麻醉中的應用價值也很突出，患者使用七氟醚后蘇醒快，術后神經功能評價恢復的時間較早，有利于早發現術后并發癥。七氟醚還有對腦血管擴張作用弱的優點，也使其應用更為廣泛[10，11]。但是，七氟醚對膿毒癥肝損傷的研究較少，為了探討七氟醚對膿毒癥肝損傷是否有保護作用，本實驗通過制備膿毒癥肝損傷大鼠模型，對七氟醚的作用進行了研究。膿毒癥最易導致肝損傷，而肝損傷對機體有很大的危害。所以，我們首先觀察了假手術組、膿毒癥組和七氟醚組大鼠肝組織病理學變化情況，結果發現七氟醚對大鼠肝組織損傷有一定的保護作用。

LFA-1是白細胞上的重要粘附分子，是衡量炎癥反應的重要指標。LFA-1屬于β2家族整合蛋白，有α鏈和β鏈兩個亞單位，分布于白細胞上，參與免疫細胞激活的殺傷效應，還與白細胞的定位、滲出、遷移等有關。已有研究表明，LFA-1介導的信號轉導在淋巴細胞增殖、活化、遷移等活動中有重要的作用，并且可產生協同刺激信號，共同影響淋巴細胞的分化和凋亡[12，13]。MAC-1位于白細胞表面，是參與機體防御作用及免疫反應的重要的粘附分子，其粘附過程與白細胞游走滲出到炎癥部位有關。因此，MAC-1的粘附功能對炎癥的發生具有重要的意義[14]。本研究檢測了膿毒癥大鼠肝組織LFA-1和MAC-1蛋白的表達情況，結果發現七氟醚有顯著的下調LFA-1和MAC-1表達的作用，可能與七氟醚緩解膿毒癥造成的炎癥反應有關。

LFA-1和Mac-1與它們的對應受體（counterreceptors），如細胞間粘附分子（ICAM-1、ICAM-2）、連接粘附分子（junctional adhesion molecules，JAM-A、JAM-C）和高級糖化端產物（advanced glycation end products，RAGE）受體對中性粒細胞聚集起非常重要的促進作用。這個瀑布過程中潛在的配體特異性結合機制仍然不明[15，16]。多形核白細胞（PMN）從血液循環聚集到感染部位或無菌傷口，表現出很多效應細胞的功能，如吞噬、脫顆粒、釋放中性粒細胞細胞外誘導劑（neutrophil extracellular traps，NETs）等，成為機體抵御入侵病原體和組織損傷防御的第一防線。通常，白細胞聚集瀑布是一個多步驟的過程，包括捕獲、滾動、慢滾、制動（硬粘附）、粘附加強和擴散、腔內爬行、細胞旁或跨細胞遷徙等。除了選擇素介導的捕獲和滾動外，兩個β2整合素成員，LFA-1和Mac-1以及它們的對應受體在促進接下來的白細胞聚集瀑布過程中發揮關鍵作用。LFA-1和Mac-1是表達于白細胞表面的α、β異質二聚體的跨膜糖蛋白。除了它們常見的內皮配體ICAM-1 and ICAM-2外，另在內皮細胞表面發現了JAM-A、JAM-C和RAGE也是它們的配體。JAM-A直接與LFA-1而不是與Mac-1發生作用，而JAM-C和RAGE直接與Mac-1而不是LFA-1作用。因此，就PMN聚集而言，必須從生理學的角度才能闡明配體特異性的β2整合素功能[17]。

大量的研究證據表明PMN聚集呈組織和刺激特異性，主要依賴于β2整合素和它們的各種各樣的配體的表達和功能發揮。一方面，LFA-1 and Mac-1在不同組織與它們的對應配體呈現出特質的功能，如在肌肉組織，LFA-1和Mac-1功能各異，即LFA-1負責介導初始的粘附，而Mac-1接管后來的腔內爬行。然而，LFA-1-ICAM-1和Mac-1-RAGE合作作用介導創傷誘發的白細胞粘附、爬行和遷徙。在肝竇，Mac-1在PMN粘附和爬行方面占主導，而LFA-1只輕微地影響爬行速率。相反，Mac-1只是通過IL-10選擇性地下調內毒素（LPS）誘導的炎癥反應，引起整合素非依賴的，CD44依賴的肝內PNM聚集。另一方面，在各種生理刺激下，β2整合素的相同配體可能作用不同。例如，在肌肉微環境中，在IL-1β誘導，而不是MIP-2誘導的PMN爬行過程中需要ICAM-2的協助。JAM-C過表達能通過IL-1β刺激肌肉小靜脈PNM粘附和遷徙。這些看似矛盾的觀察結果主要是由于組織或刺激特異性的LFA-1或 Mac-1與它們的多種配體之間的相互作用及分子表達和分布主導著血流中內皮內PMN的作用強度、爬行和遷徙速度[18-20]。

本研究發現七氟醚可以通過下調炎癥相關因子LFA-1和MAC-1表達對膿毒癥造成的肝損傷起到保護作用，而應用七氟醚行各類大型手術的麻醉具有重要的臨床意義。