自體外周血干細胞移植治療乙型肝炎肝硬化患者療效及安全性分析

趙芳芳，翟永貞，馮國和

我國最常見的導致肝硬化的病因為乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染[1，2]。在乙型肝炎肝硬化的早期，通常由于肝臟處于代償期而無明顯的癥狀，但隨著病情進展，肝臟功能失代償而出現各種并發癥，預后極差[3]。除護肝、抗病毒和對癥治療外，肝移植是治療終末期肝病的唯一根治手段，但多種因素制約其發展[4-7]。近年來，隨著再生醫學的興起，干細胞因其具備多向分化潛能、促進肝臟自我更新、減輕肝臟免疫損傷和纖維化等作用而備受關注[8]。干細胞移植已經成為有前途的治療肝硬化的方法。常用的干細胞通常來源于臍帶、骨髓、肝本身或外周血，其中自體外周血干細胞（autologous peripheral blood stem cells，PBSCs）具有來源方便、無排斥反應、操作簡便、成本低等優點[9-11]，將PBSCs直接注入肝固有動脈是常用的移植方法[12]。目前，關于自體外周血干細胞移植（autologous peripheral blood stem cells transplantation，APBSCT）治療肝硬化的可行性研究尚不全面。本研究采用APBSCT治療乙型肝炎肝硬化患者，觀察了療效及其安全性情況，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 2014年3月～2016年2月本院感染病科收治的乙型肝炎肝硬化患者100例，男78例，女22例；年齡35～60歲，平均年齡為（42.2±4.5）歲。符合《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年更新版）的診斷標準[13]，Child-Pugh B 級 44例，Child C級56例，平均評分（10.5±2.4）分。排除標準：①肝癌或其他腫瘤患者；②血清肌酐 ＞132.6 μmol/l、存在肺和心臟疾病者；③合并丙型肝炎病毒（HCV）或人類免疫缺陷病毒（HIV）感染者；④有肝內外膽道梗阻性疾病證據，如原發性硬化性膽管炎或超聲波檢查見膽總管擴張；⑤多普勒超聲檢查見有肝靜脈、門靜脈或脾靜脈栓子形成；⑥有嚴重的消化道出血和腹腔感染者；⑦妊娠。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準，所有入選患者均簽署書面知情同意書。

1.2 APBSCs的采集和分離 給予患者重組人粒細胞集落刺激因子（rhG-CSF，白特喜，山東科興生物制品有限公司）300 μg皮下注射，連續4 d。檢測外周血白細胞計數。當外周血白細胞≥10.0×109/L，單核細胞≥1.0×109/L時，滿足干細胞采集條件。使用美國Spectra血細胞分離機采集PBSC懸液約150 ml。在采集過程中，監測血壓和心率，給予患者口服或注射碳酸氫鈣，以避免檸檬酸反應引起低鈣血癥而導致的口周麻木、手足抽搐等。自機采袋中取樣，用電子血細胞計數器計算有核細胞總數。當監測到CD34+干細胞計數占單核細胞比例≥0.5%時，使用流式細胞儀進行分離，保證每次分離的 CD34+干細胞數量不少于（2～4）×106cells/ml。

1.3 APBSCT的實施 將患者分成兩組，其中一組在我院放射介入科接受細胞移植治療。具體過程如下：局部麻醉，行右側股動脈穿刺，將導管通過降主動脈、腹主動脈置入肝固有動脈。當肝固有動脈顯影后，將PBSC懸液100 ml緩慢注入肝固有動脈。術后拔管，穿刺點局部加壓包扎，患肢制動6 h，臥床24 h。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0統計軟件進行分析,計數資料比較采用 x2檢驗；計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不良反應 所有患者均對治療方案耐受，未出現血栓形成、出血或明顯的肝功能惡化。與注射rhG-CSF相關的主要不良反應為低熱、肌肉骨骼疼痛、疲倦，其他癥狀輕微。隨著停藥，癥狀消失。除1例患者出現輕微的口周麻痹，給予減慢采血速度并給予補鈣后，癥狀緩解外，其余患者均安全度過白細胞采集期而無并發癥發生。隨訪期間，兩組發生上消化道出血、自發性細菌性腹膜炎（spontaneous bacterial peritonitis，SBP）、肝性腦病等肝硬化并發癥的數次和進展為肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的例數方面無明顯差異。其中1例（5%）移植組患者在移植后4個月時出現HCC，經介入治療6個月后死亡。另外1例（5%）移植組患者在移植后6個月時出現腎上腺腫塊，原因未明；2例（10%）對照組患者在隨訪過程中發生HCC。

2.2 兩組肝功能指標變化的比較 在移植后6 m，移植組血清ALB水平顯著高于，而Child-Pugh評分顯著低于對照組（P＜0.05，表1）。

3 討論

近年來，干細胞的潛能、屬性、可用性和風險在國內外被反復報道[14，15]。過去十余年臨床干細胞移植方面的初步經驗為干細胞療法可以有效治療某些肝臟疾病提供了證據。近年來的研究發現，間充質干細胞可通過對造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）施加多種協同性影響而減少在肝組織重塑過程中的炎癥和纖維化程度[16]，而動物實驗證實純化的干細胞能轉化為肝細胞，減少肝臟損傷導致的致命性肝衰竭的發生[17]。

表1 兩組肝功能指標（±s）比較

表1 兩組肝功能指標（±s）比較

與對照組比，①P＜0.05

例數 TBIL（μmol/L） ALB（g/L） INR Child-Pugh評分移植組 術前 50 59.2±10.8 30.3±2.7 1.4±0.8 10.5±2.4術后1 m 50 34.5±17.2① 35.3±3.2① 1.2±1.3 8.2±2.3術后 3 m 49 57.6±15.1 31.0±3.8 1.1±0.9 8.5±5.3術后 6 m 47 63,7±18.4 30.6±4.4① 1,5±0.3 8.4±2.1①移植組 術前 50 58.3±21.1 31.4±3.3 1.3±2.0 9.1±5.5術后 1 m 49 59.3±12.8 30.2±1.5 1.3±11 9.5±4.8術后 3 m 47 62.6±15.3 30.0±2.2 1.4±0.6 9.2±3.0術后 6 m 46 67.3±16.7 27.6±1.9 1.6±1.5 9.7±3.3

在外周血中，以CD34+為主要標記的干細胞在組織損傷后血管再生過程中發揮重要作用[18]。臨床研究亦證實CD34+細胞水平在肝切除術后顯著增加[19]。因此，自體外周血CD34+的干細胞移植有可能改善肝硬化患者的肝功能及逆轉肝組織學改變。本文通過病例對照研究評估了失代償期乙型肝炎肝硬化患者在APBSCT治療后的安全性和可行性，同時通過分析肝臟生化指標、Child-Pugh評分、隨訪患者生活質量等指標評估了干細胞移植的效果。

所有患者對rhG-CSF動員均有效果，有明顯的白細胞計數增加，但干細胞的產量仍低于那些健康的捐贈者[20]。大部分患者在白細胞分離時耐受良好，只有少數出現結果中提到的副反應，與已報道的關于酒精性肝硬化患者注入外周血干細胞的安全性和有效性的初步研究結果一致[21]。移植組在自體PBSCT后1個月TBIL顯著下降，后幾個月里無明顯變化，但仍有患者在移植后3個月時和6個月時血清膽紅素繼續下降，與既往報道的接受自體PBSCT患者血清總膽紅素改善的結果一致[22]。血清肝臟酶類水平的下降與炎癥過程的降低相平行，也應該在干細胞移植前后有所變化。在APBSCT后1個月，移植組患者血PT或INR均有顯著改善，但與對照組之間無顯著性差異，提示隨著自體PBSCT后肝臟炎癥的減輕，肝臟的凝血功能有短暫的改善不持久。

由于干細胞具有再生能力，實驗研究證實其能在肝臟環境下轉化為肝細胞[23]。所以，理論上來說可以觀察到肝臟體積的增大。但整個隨訪觀察期進行的腹部超聲檢查顯示移植組在APBSCT前后肝臟大小無顯著性變化，與對照組比也無顯著性差異，可能是由于患者處于肝硬化階段，肝臟體積的變化已經難以觀察到，或許提示如果在肝硬化早期進行APBSCT治療可能效果更好。還有可能由于腹部超聲在檢測肝臟大小的微小變化方面能力有限。雖然CT和MRI檢查更靈敏，但價格相對昂貴，不利于隨訪觀察[24]。

G-CSF注射可以引起外周血干細胞捐獻者和血液腫瘤患者脾臟增大[25]。理論上來說，脾腫大者應用G-CSF，尤其是肝硬化患者，也會增加脾功能亢進的風險。因此，入選的移植組患者脾臟長徑在16～22 cm之間，明顯腫大者被排除。事實上APBSCT后脾臟大小無顯著變化。在既往國內外的研究中，健康捐獻者在G-CSF動員后其脾臟體積增加的中位值顯著高于血液腫瘤患者[26]，可能在慢性脾腫大時脾臟彈性相對減小，G-CSF刺激不會引起其體積的突然變化。相反，如果之前脾臟體積正常，那么可能會在短期內顯著增大，從而增加脾功能變化的可能性。

另外，應用腹部超聲檢查對腹水量進行臨床評估，發現移植組在自體PBSCT前后或兩組之間腹水量均無統計學差異性變化。可能由于腹水形成的病理生理機制復雜，不易在短期內改變。關于Child-Pugh評分，移植組APBSCT后1個月有顯著的下降，其中4例患者在整個隨訪調查期均有持續的下降，另5例患者也有持續下降超過3個月。盡管兩組之間無顯著性差異，但在隨訪期間，移植組Child-Pugh評分一直在下降。

本研究中，所有的移植組患者生活質量均有所提高，尤其是在APBSCT后前3個月，可能與肝臟功能的改善有關。通過兩組對比，我們還發現APBSCT并未明顯影響肝性腦病、上消化道出血和SBP的發生，而移植組食管靜脈曲張分級也無明顯改善（資料未列出）。1例移植組患者在4個月后發現HCC，而另1例患者在6個月后出現腎上腺包塊。對照組2例患者在隨訪調查期內確診為HCC。5例患者在APBSCT后第1年出現嘔血或肝性腦病而死亡，而對照組6例患者在隨訪觀察期的第1年內死亡，兩組之間病死率無顯著性差異。

綜上所述，我們可以發現在乙型肝炎肝硬化患者進行APBSCT治療是安全、可行的，且能有效地改善其生活質量和肝功能指標。