圍手術期應用烏司他丁治療對肝細胞癌患者肝切除術后外周血Th22細胞百分比和血漿白細胞介素-22的影響*

朱 俊，丁 瑩，王世清，張 野，劉 野，劉澤剛

肝切除術是治療肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）最有效的方法，但手術應激和術后炎癥反應等均可導致肝臟損傷，造成術后肝腎功能異常。有研究發現，在圍手術期給予肝切除患者皮質激素或烏司他丁可在一定程度上改善術后肝功能損傷[1，2]，但其機制尚未完全闡明。輔助性T細胞22（T helper 22，Th22）是新近發現的CD4+T細胞亞群，能分泌白細胞介素 -22（interleukin-22，IL-22），并為其主要的效應細胞因子，在機體炎癥反應應答過程中發揮重要的作用[3，4]。本研究檢測了接受肝切除手術的HCC患者外周血Th22細胞和血漿IL-22水平，為研究烏司他丁調控肝臟炎癥的機制假說提供新的試驗依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年7月～2017年4月解放軍昆明總醫院普通外科收治的接受肝切除術治療的HCC患者88例（男62例，女26例；平均年齡為51.3±9.1歲；肝功能Child-Pugh A級47例，B級41例），符合美國肝病研究學會發布的診斷標準[5]，肝臟出現結節＞1 cm，在增強CT或MRI檢查時呈典型的“快進快出”征象，即動脈相顯示血管豐富，但門靜脈期消退；術后經組織病理學檢查證實為HCC。納入標準：年齡＞18歲，Child-Pugh A級或B級，美國東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）活動狀態評分為0分或1分。排除標準：轉移性肝癌、術前影像學檢查發現存在肝外轉移灶、有原發性腦、腎、肺重大疾病和Child-Pugh C級患者。同時，選擇30例（男22例，女8例；平均年齡為49.7±12.4歲）年齡和性別相匹配的健康志愿者為對照組。本研究方案已通過解放軍昆明總醫院醫學倫理委員會批準，所有入組人群簽署知情同意書。

1.2 治療方法 在88例HCC患者中，行半肝切除術治療29例，肝葉切除術治療49例，肝段切除術治療10例。所有患者均采用解剖性肝切除術，采用鉗夾法斷肝，采用Pringle手法阻斷第一肝門，控制入肝血流，肝門阻斷時間為（41.5±4.6）min。術后常規給予保肝、止血、營養支持、維持電解質平衡等對癥治療。部分患者在術后，給予烏司他丁（廣東天普生化醫藥股份有限公司，國藥準字H19990134）30萬單位溶于50 ml生理鹽水中緩慢靜脈推注，3次/d，連續注射7 d；其余患者則不給予烏司他丁治療。

1.3 血漿IL-22水平和外周血Th22細胞檢測 采用ELISA法檢測血漿IL-22水平（使用美國R&D公司提供的試劑盒）；使用Sigma公司提供的淋巴細胞分離液和采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC），調整細胞數至1×107個/管，凍存于液氮中備檢。取1×106個PBMCs，移入FACS管，加入 PMA（終濃度 5 ng/ml）、伊烏諾霉素（終濃度500 ng/ml）和莫能霉素（終濃度 10 ng/ml），于 37℃、5%CO2條件下刺激培養 12 h。洗滌后，加入抗人CD3-APC和抗人CD4-FITC（美國BD Bioscience公司） 各 10μl，4℃避光孵育 20 min，PBS洗滌2次，加入BD Cytofix/CytoPerm溶液200μl，室溫、避光孵育 30 min，4℃、500 g 離心 3 min，加BD Perm/Wash緩沖液洗滌2次，加入用Perm/Wash緩沖液稀釋的抗人IL-22 PerCP（美國BD Bioscience公司），冰上避光孵育30 min，加Perm/Wash緩沖液洗滌2次，加入含4%多聚甲醛的PBS固定，上FACS Calibur流式細胞儀分析。采用CellQuest Pro軟件獲取細胞，采用FlowJo8.4.2軟件分析，表型為CD3+CD4+IL-22+的細胞為Th22細胞。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件進行數據分析。對于符合正態分布的計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；對于非正態分布的計量資料以[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 在肝切除術后接受常規治療者51例，給予烏司他丁治療者37例，兩組患者人口學和臨床資料比較，無顯著性差異（P＞0.05，表1）。

表1 兩組HCC患者人口學和臨床資料【%，（±s），M（P25，P75）】 比較

表1 兩組HCC患者人口學和臨床資料【%，（±s），M（P25，P75）】 比較

常規治療（n=51） 烏司他丁（n=37）男性 34（66.7） 28（75.7）年齡（歲） 50.8±9.9 53.2±7.1 Child-Pugh A級 26（50.9） 21（56.8）Child-Pugh B級 25（49.1） 16（43.2）半肝切除術 19（37.3） 10（27.0）肝葉切除術 27（52.9） 22（59.5）肝段切除術 5（9.8） 5（13.5）肝門阻斷（min） 39.5±3.5 45.1±4.9術中出血量（ml） 420.0（300.0，2800.0） 450.0（250.0，3000.0）腫瘤直徑（cm） 4.1（1.2，11.8） 4.8（1.3，12.1）

2.2 兩組肝腎功能指標變化的比較 術前，兩組血清生化指標無顯著差異（P值均＞0.05）；術后3 d和7 d，烏司他丁治療組血清ALT和AST水平顯著低于常規治療組（P值均＜0.05，表2）。

2.3 HCC患者與健康人外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平比較 HCC患者外周血Th22百分比顯著高于健康人【（1.4±0.3）% 對（0.8±0.1）%，P＜0.0001】，HCC 患者血漿 IL-22水平亦顯著高于健康人【（116.9±32.6） pg/ml對（42.1±18.2）pg/ml，P＜0.0001】 。

2.4 兩組外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平比較 術后3 d和7 d，烏司他丁治療組外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平顯著低于常規治療組（P值均 ＜0.05，表3）。

表2 兩組血清肝腎功能指標【（±s），M(P25，P75)】 的比較

表2 兩組血清肝腎功能指標【（±s），M(P25，P75)】 的比較

與常規治療組比，①P＜0.05

常規治療（n=51） 烏司他丁（n=37）ALT（IU/L）術前 41.4（23.4，184.1） 42.1（24.1，192.3）術后 3 d 450.6（56.1，820.7） 219.4（40.1，510.9）①術后 7 d 115.4（35.7，625.2） 72.4（25.6，471.5）①AST（IU/L）術前 38.6（19.7，117.3） 40.9（15.1，109.4）術后 3d 257.3（115.3，7265） 108.8（82.5，439.1）①術后 7d 90.5（45.5，293.8） 61.4（29.4，351.4）①TBIL（μmol/L）術前 27.9±5.9 30.1±6.7術后 3d 56.1±8.3 47.7±4.9①術后7d 42.3±7.6 42.4±4.8 BUN（mmol/L）術前 4.2±1.1 4.6±1.1術后3d 4.3±1.2 4.5±1.2術后7d 4.3±0.9 4.5±0.9 Cr（μmol/L）術前 59.2±12.9 63.6±9.9術后3d 60.7±9.9 66.6±8.7術后7d 66.9±10.9 60.3±7.9

表3 兩組外周血Th22細胞（%）和血漿IL-22水平（±s）比較

表3 兩組外周血Th22細胞（%）和血漿IL-22水平（±s）比較

與常規治療組比，①P＜0.05

常規治療（n=51） 烏司他丁（n=37）外周血Th22細胞術前 1.4±0.3 1.3±0.3術后3 d 1.3±0.2 1.2±0.4術后 7 d 1.3±0.2 1.1±0.3①血漿 IL-22（pg/ml）術前 119.3±34.2 113.5±30.4術后3 d 109.7±29.8 98.1±20.1術后 7 d 110.7±37.1 94.1±24.8①

3 討論

由于術中肝臟血流阻斷和第一肝門開放造成的缺血/缺氧和再灌注，導致肝臟損傷和明顯的肝功能異常。同時，絕大多數HCC患者均罹患慢性肝臟疾病，如病毒性肝炎、肝硬化等，手術應激所致的炎癥介質釋放不但可加重肝功能損傷，還能造成腎臟、心臟、中樞神經系統等多臟器功能不全[6]。烏司他丁是尿胰蛋白酶抑制劑，可清除氧自由基、抑制炎癥介質釋放，改善免疫細胞功能，具有較強的抗炎效果，在多種危重癥患者治療中均可發揮保護肝、腎功能的作用[7-9]。本研究發現，兩組HCC患者接受肝切除術后第3天血清轉氨酶水平有所升高，至術后第7天有所下降。但烏司他丁治療組在術后第3天和第7天血清轉氨酶水平均顯著低于常規治療組，但血清TBIL水平在兩組未見明顯差異，一方面說明HCC患者接受肝切除術的安全性較高，絕大多數患者未發生嚴重的肝細胞損傷；另一方面說明烏司他丁能改善患者術后肝功能狀態，有利于患者術后恢復，與既往在肝臟圍手術期應用烏司他丁治療的結果一致[2，9]，可能與烏司他丁在一定程度上能抑制機體炎癥應答有關[10-12]，但其中的機制仍有待進一步研究。

Th22細胞是一類新發現的CD4+T細胞亞群，主要分泌IL-22和腫瘤壞死因子-α，但不表達IL-17和干擾素 -γ[3，13，14]。IL-22 是 Th22 細胞最主要的效應細胞因子，而IL-22在多種疾病發病過程中根據其表達部位和表達量的不同可發揮促進炎癥應答和保護細胞免受損傷的雙重作用[15]。Th22細胞及其分泌的IL-22在乙型肝炎病毒感染[16]、丙型肝炎病毒感染[17]、藥物性肝損害[18]和慢加急性肝衰竭患者[19]水平均明顯升高。動物實驗亦證實Th22細胞和IL-22在肝臟疾病發病過程中主要發揮促進炎癥應答的作用[11]。IL-22還可促進肝癌細胞的增殖[20]，Th22細胞亦與HCC的發生發展密切相關。本研究發現，HCC患者外周血Th22細胞百分比和血漿IL-22水平顯著高于健康人，與既往的研究結果一致。加用烏司他丁治療的HCC患者在接受常規肝切除術治療后血Th22細胞和IL-22水平降低，可能與烏司他丁能抑制炎癥應答反應有關，結合烏司他丁能降低血清轉氨酶水平而表現出的肝臟保護作用，我們認為烏司他丁可能抑制了Th22細胞應答。