有機氮源添加對嗜熱厭氧桿菌產乙醇的影響

任夢夢，傅宏鑫，馬毅，王菊芳

（華南理工大學，廣東廣州 510006）

隨著經濟全球化進程的加快，能源供需矛盾、生態環境惡化等問題日益突出[1]。一次性能源消耗持續增加，使用過程嚴重污染環境，產生氮氧化物、硫氧化物、一氧化碳、二氧化碳、甲烷以及有毒的粉塵等[2]。因此，節能減排面臨巨大挑戰，尋找綠色可再生的替代能源迫在眉睫。

生物質能源具有資源豐富、分布廣泛、可再生、清潔、安全等優點。地球上每年通過光合作用合成的生物質約有1 800億噸，蘊含其中的能量是世界能源消耗總量的10～15倍，但利用率低于3%，生物能源的開發利用，市場前景廣闊。生物燃料乙醇具有較高的辛烷值，享有“液體黃金”的美譽，廣泛應用于化工、醫療、國防和食品等領域。由于世界糧食緊缺，以糧食為原料生產第一代乙醇必將導致“與人爭糧、與糧爭地”的現象發生[3]，嚴重阻礙燃料乙醇的工業化發展。因此，利用“非糧”生物質合成乙醇是最切實可行的生物燃料生產方式。

許多嗜熱厭氧菌能直接降解纖維素和半纖維素，這使得它們成為研究乙醇生產的熱點[4]。同時它們還具有如下一些優勢：第一，具有廣泛的底物譜，能夠利用纖維素水解液中的五碳糖和六碳糖（主要是葡萄糖和木糖）；第二，對環境的耐受性較強，在較寬的pH和溫度范圍內都能保持良好活性；第三，較高的操作溫度易于產物的分離純化且不易被污染。本課題組前期篩選得到一株嗜熱厭氧桿菌，鑒定為Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27[5]。通過阻斷嗜熱厭氧桿菌的乳酸合成途徑，獲得突變株T.aotearoense SCUT27Δldh的乙醇得率提高2倍[6]，而且其能夠高效利用木薯漿水解液為底物發酵生產乙醇[7]。但是，游離細胞發酵時存在生長能力較弱、糖耗速率慢與乙醇產量低等問題。

氮源是微生物生長過程中必需的營養物質，參與細胞內許多代謝過程，可促進菌株生長，調節胞內初級代謝產物與次級代謝產物的比例，控制菌體的生長速率，影響產物的生成與底物的消耗[8]。目前，乙醇發酵中常用的有機氮源為酵母提取物、胰蛋白胨、玉米漿、氨基酸等[9]。實驗室中利用最廣泛的氮源是酵母提取物，因其能賦予菌株突出的發酵性能而廣為使用，胰蛋白胨作為一種速效氮源，也能顯著促進菌株的生長。因此，本文分別以葡萄糖、木糖及混合糖為底物，探究酵母提取物和胰蛋白胨添加對嗜熱厭氧桿菌生產乙醇的影響，為其工業化應用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

本研究所用的菌株T.aotearoense SCUT27Δldh是通過同源重組雙交換方式敲除T.aotearoense SCUT27中乳酸脫氫酶基因（ldh）獲得，具有優良的乙醇發酵性能[6]。

1.1.2 培養基配方

液體培養基采用嗜熱厭氧桿菌MTC培養基[10]。培養基成分均為分析純，其中酵母提取物和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜熱厭氧桿菌添加不同氮源的搖瓶發酵試驗

在搖瓶發酵MTC培養基中，分別以葡萄糖、木糖以及混合糖（葡萄糖、木糖的比例為2∶1）為底物，培養中分別添加1 g/L的酵母提取物、4 g/L的酵母提取物與2 g/L的胰蛋白胨、10 g/L的酵母提取物與5 g/L的胰蛋白胨，其余成分不變（以MTC培養基為對照）。將活化擴大培養后的菌株種子液于超凈工作臺內按10%的接種量（V/V）接種到120 mL的血清瓶中，在55 ℃、150 r/min條件下搖瓶發酵，在發酵過程中每隔4 h取樣用于檢測菌株的生物量以及產物、底物的含量。

1.2.2 細胞密度的測定

測定細胞的生物量時，使用紫外可見分光光度計記錄其在波長600 nm處的吸光值。

1.2.3 產物和底物濃度的測定

將發酵樣品在高速離心機中以12 000 r/min的轉速離心10 min后，取380 μL上清液和1 520 μL去離子水，并與100 μL濃度為10%（V/V）稀硫酸混勻，過濾除菌用高效液相色譜儀檢測并計算其含量。

使用高效液相色譜分析儀（HPLC，Waters 2695）檢測發酵液中各組分的含量，詳細參數如下：有機酸色譜柱為Aminex HPX-87P分離柱；檢測器為Milford RI-2414示差檢測器；流動相為2.5 mmol/L H2SO4；流速為0.6 mL/min；柱溫箱溫度為60 ℃；檢測室溫度為40 ℃；進樣量為10 μL。

2 結果與分析

2.1 有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖發酵的影響

為了進一步提高菌株的乙醇發酵性能，本研究對培養基有機氮源進行了優化。首先，以葡萄糖為底物，參照文獻[11]在MTC培養基中分別添加1 g/L酵母提取物、4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物與5 g/L胰蛋白胨。實驗結果如圖1和表1所示，在MTC培養基中添加1 g/L酵母提取物時，T.aotearoense SCUT27Δldh的生物量、葡萄糖消耗量和乙醇濃度比對照分別提高24%、28%和34%，表明酵母提取物中的氮源、氨基酸和生長因子等有效成分可以促進菌株的生長和底物的消耗（表1）。然而，低濃度酵母提取物添加對乙醇生產強度的提升不顯著。繼續增加酵母提取物濃度至4 g/L并補充適量的胰蛋白胨（2 g/L），T.aotearoense SCUT27Δldh的生物量、葡萄糖消耗量、乙醇濃度增加至5.47、21.90 g/L和7.52 g/L。值得一提的是，乙醇的生產強度是對照（MTC培養基）的2倍。當酵母提取物與胰蛋白胨添加量分別達到10 g/L與5 g/L時，乙醇發酵性能無進一步提升，以上結果表明適量無機氮源添加能顯著改善菌株生長和葡萄糖的利用。

圖1 有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖發酵的影響

表1 有機氮源對T.aotearoense SCUT27Δldh利用葡萄糖發酵產乙醇的性能比較

2.2 有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖發酵的影響

木糖是世界上除葡萄糖外第二豐富的碳源，也是木質纖維素水解液的主要成分[12-13]，因此本研究還考察了有機氮源對T.aotearoense SCUT27Δldh木糖發酵產乙醇的影響。結果如圖2和表2所示，與葡萄糖發酵相比，菌株利用木糖的能力較弱，如MTC培養基中細胞生物量僅為1.99（葡萄糖發酵時生物量為2.62），底物消耗量和乙醇產量降低37%和41%，這一結果與木糖發酵產生較少ATP相一致。當酵母提取物添加濃度為1 g/L時，菌株生物量和乙醇生產無顯著變化，說明菌株利用木糖發酵（相對于葡萄糖發酵）需要提供更為豐富的氮源。如預期的一樣，繼續增大酵母提取物濃度至4 g/L并添加2 g/L胰蛋白胨，T.aotearoense SCUT27Δldh OD600的生物量、木糖消耗量和乙醇濃度與對照（MTC培養基）相比，分別提高41%、50%和53%。與葡萄糖發酵類似，該條件下乙醇生產強度與對照相比提高了91%，且繼續提高有機氮源添加對發酵性能提升無顯著影響。

2.3 有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖發酵的影響

圖2 有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖發酵的影響

表2 有機氮源對T.aotearoense SCUT27Δldh利用木糖發酵產乙醇的性能比較

圖3 有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖發酵的影響

表3 有機氮源對T.aotearoense SCUT27Δldh利用混合糖發酵產乙醇的性能比較

菌株T.aotearoense SCUT27Δldh的最大優勢在于能利用木質纖維素水解液中的葡萄糖和木糖，即木糖的利用沒有受到碳代謝阻遏的影響，因此最后本研究考察了有機氮源添加對T.aotearoense SCUT27Δldh混合糖（葡萄糖、木糖的比例為2∶1）發酵產乙醇的影響。發酵結果如表3和圖3所示，以混合糖為底物發酵的結果與葡萄糖和木糖發酵基本一致，T.aotearoense SCUT27Δldh的生長，底物利用、乙醇產量和生產強度隨有機氮源濃度的提高而提高。在最佳氮源（4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨）條件下，細胞生物量、乙醇產量、得率與生產強度分別為5.18、7.58 g/L、0.36 g/g、0.38 g/L·h。值得一提的是，在MTC培養基和低濃度酵母提取物添加的MTC培養基中，發酵起始階段木糖的利用出現延遲（圖3A和3B），但是這一現象隨著氮源濃度的提高得到解決（圖3C和3D），表明混合糖的高效共利用需要充足的氮源供給。

綜上所述，無論是利用葡萄糖、木糖甚至是混合糖發酵，4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨對菌株的乙醇發酵性能促進均最為顯著，且能有效提高乙醇生產強度和實現混合糖共利用。

3 結論

針對嗜熱厭氧桿菌T.aotearoense SCUT27Δldh乙醇發酵存在生長能力較弱、糖耗速率慢與乙醇產量低等問題，本文致力于通過優化培養基的有機氮源組成和濃度來改善菌株的生長、提高乙醇生產和底物利用能力，具體結論如下。

（1）以葡萄糖、木糖和混合糖為碳源時，在培養基中添加4 g/L酵母提取物與2 g/L胰蛋白胨時，乙醇發酵性能最佳，生產強度提升91%～111%。

（2）T.aotearoense SCUT27Δldh對木糖的利用能力低于葡萄糖，因此菌株在木糖和混合糖發酵時，充足的氮源供給有利于乙醇發酵性能的提升、實現葡萄糖和木糖的高效共利用。