重組大腸桿菌產人成纖維細胞生長因子8a工業(yè)化發(fā)酵工藝優(yōu)化

王莉潔，孫丹，羅春艷

（1.遼寧何氏醫(yī)學院健康營養(yǎng)學院，遼寧沈陽 110163；2.沈陽眼產業(yè)技術研究院有限公司，遼寧沈陽 110163）

人成纖維細胞生長因子家族（Human Fibroblast growth factors，hFGFs）是一群具有多種生理功能的生長因子，FGF8（fibroblast growth factor 8）是1992年由Tanaka等[1]在雄性激素依賴性小鼠乳腺癌SC-3細胞系中分離出來的，其在胚胎發(fā)育、血管生成和傷口愈合上，對組織和細胞的增殖和分化起著重要作用，是胚胎發(fā)育中不可缺少的生長因子之一。hFGF8a由233個氨基酸組成，具有4種亞型：FGF8a、FGF8b、FGF8e和FGF8f[2-4]。近年來，生物制藥技術發(fā)展迅猛，引起了國內生物制藥公司的廣泛關注，生物發(fā)酵方法有助于實現制藥工藝的標準化、產業(yè)化、規(guī)模化的發(fā)展。基因工程制藥的快速發(fā)展也開發(fā)了一系列針對疑難雜癥的藥物，通過生物發(fā)酵技術開拓了藥物生產來源的供給途徑。目前，FGF具有廣泛的生物學活性和重要的臨床應用價值，然而，重組人成纖維細胞生長因子8a（recombinant human fibroblast growth factor 8a，rhFGF8a）作為一種新型的治療手段，其生產成本和生物發(fā)酵生產的穩(wěn)定性等核心問題有待解決，本文以產rhFGF8a多肽的重組大腸埃希菌[5]為研究對象，考察兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對其工業(yè)發(fā)酵生產的穩(wěn)定性、表達量和產量的影響，為該重組大腸埃希菌在規(guī)模化生產中提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種

重組基因工程菌大腸桿菌BL21（Escherichia coli），菌體中含有FGF8a基因，基因來源于人成纖維細胞中，由華僑大學林俊生教授饋贈。

1.2 主要試劑

大豆胨、胰化蛋白胨、酵母提取物，購自OXIOID公司；氯化鈉、磷酸氫二鉀、葡萄糖購自國藥試劑公司；卡那霉素、異丙基β-D-硫代半乳糖苷（簡稱IPTG），購自Inalco公司；純化試劑，購自北京康為世紀公司。

1.3 主要儀器

生物凈化工作臺，蘇州凈化有限公司生產；全溫振蕩培養(yǎng)搖床、恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒儀器有限公司生產；蛋白電泳儀，美國伯樂公司生產；脫色震蕩搖床，北京六一儀器有限公司生產；低溫冷凍離心機，美國艾本德公司生產；細胞超聲破碎儀，寧波新芝儀器公司生產；磁力攪拌發(fā)酵罐（50 L），上海保興儀器公司。生產

1.4 主要溶液與培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基1：稱取大豆胨90 g、氯化鈉150 g、磷酸氫二鉀75 g、葡萄糖75 g、胰化蛋白胨510 g，加入30 L H2O，待滅菌后冷卻為40 ℃時加入卡那霉素50 mg/mL儲液（終濃度為50 μg/mL），倒入發(fā)酵罐中121 ℃滅菌30 min，滅菌后降至37 ℃?zhèn)溆谩Ｕ{節(jié)pH 7.2。

液體培養(yǎng)基2：稱取氯化鈉300 g、酵母提取物150 g、胰化蛋白胨300 g，加入30 L H2O，待滅菌后冷卻為50 ℃時加入卡那霉素50 mg/mL（終濃度為50 μg/mL），倒入發(fā)酵罐中121 ℃滅菌30 min，滅菌后降至37 ℃?zhèn)溆谩Ｕ{節(jié)pH 7.2。

卡那霉素（50 mg/mL）儲液：稱取50 g卡那霉素加入1 L H2O溶解，用0.22 μm濾膜，過濾滅菌后的補料瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

IPTG（1 mmol/L）儲液：稱取240 g IPTG粉末加入1 L H2O溶解，用0.22 μm濾膜，過濾滅菌后的補料瓶中避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 試驗方法

1.5.1 菌種活化

取低溫保藏的甘油菌株50 μL接種到50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min過夜活化。

1.5.2 不同培養(yǎng)基的發(fā)酵人FGF8a重組大腸桿菌種子液生長曲線

分別選擇1.4中液體培養(yǎng)基1與液體培養(yǎng)基2各250 mL，加入卡那霉素（Kanamycin，Kan）100 mg/mL，接入活化后的重組菌液250 μL，200 r/min、37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)，分別測定其生長情況。

1.5.3 不同培養(yǎng)基中人FGF8a的重組大腸桿菌中發(fā)酵誘導表達與產量測定

分別取上述不同培養(yǎng)液的重組人FGF8a工程菌種子液，按照1∶50比例分別接入30 L的液體培養(yǎng)基1（含卡那霉素）與液體培養(yǎng)基2（含卡那霉素）中培養(yǎng)，轉速200 r/min，通氣量20%，采用1 mol/L NaOH與0.5 mol/L HCl全程自動控制pH，當菌體OD600=0.8時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG，28 ℃誘導16 h，結束發(fā)酵后，5 000 r/min 4 ℃離心15 min，收集菌體，加入細菌裂解液，采用超聲破碎儀進行破碎后，進行SDS-PAGE電泳檢測，觀察菌體總蛋白與目的蛋白表達量情況，測定其hFGF8a產量。同時，取未加IPTG的菌液作為對照組。

1.5.4 重組菌中人成纖維細胞生長因子8a的Western blot鑒定

取相同濃度下液體培養(yǎng)基1與液體培養(yǎng)基2發(fā)酵培養(yǎng)后提取的總蛋白溶液，經SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF膜上，進行電轉，5%脫脂奶粉封閉30 min，在鼠抗6×HIS抗體中4 ℃孵育過夜。次日膜進行TTBS清洗，在羊抗小鼠IgG-HRP的二抗中孵育1 h，通過ECL發(fā)光試劑盒顯影曝光，鑒定hFGF8a，并定量其表達量，膜采用麗春紅進行染色。

2 結果與分析

2.1 不同種子液培養(yǎng)基培養(yǎng)人FGF8a重組菌的生長測定

在培養(yǎng)種子過程中，液體培養(yǎng)基1與液體培養(yǎng)基2中種子菌株均從延滯期開始復蘇，隨后在2 h后進入指數生長期，在16 h后進入平緩期，如圖1所示。因此，選取16 h后進行誘導表達，此時細胞活力和質粒穩(wěn)定性較強，可縮短發(fā)酵周期，降低成本。

圖1 不同種子液培養(yǎng)基人FGF8a重組菌生長曲線

由圖1可知，液體1號培養(yǎng)基與液體2號培養(yǎng)基在菌株活化與種子液培養(yǎng)上，生長趨勢與時間并無較大差距。16 h后菌體活力比較液體2號存在下降趨勢，兩種培養(yǎng)基均可以用于菌株活化與種子液培養(yǎng)。

2.2 人成纖維細胞生長因子8a的重組菌的表達

通過液體1號培養(yǎng)基與液體2號培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)的重組菌，用1 mmol/L IPTG進行誘導表達，16 h后提取菌體總蛋白，進行SDS-PAGE電泳分析，兩種培養(yǎng)基在預期分子量大小位置均出現明顯的蛋白條帶（圖2），且液體2號培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)后的重組菌在誘導后rhFGF8a蛋白的表達明顯。

圖2 不同培養(yǎng)基發(fā)酵下人FGF8a重組菌的SDS-PAGE分析

2.3 人成纖維細胞生長因子8a的重組菌的Western blot鑒定

經過BSA方法蛋白含量測定后，調整不同培養(yǎng)基發(fā)酵誘導后的菌體總蛋白含量，使其保持一致后，經Western blot鑒定該蛋白條帶為rhFGF8a（圖3）。由圖3可知，液體2號培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中重組人FGF8a的表達量高于液體1號培養(yǎng)基，因此，選擇液體2號培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基。通過表達量計算得出液體2號培養(yǎng)基獲得的重組人FGF8a產量在80 mg/L。

圖3 Western blot鑒定重組菌中人FGF8a表達

3 討論

我國生物技術起步較晚，經過近三十年的迅速發(fā)展，生物技術基礎研究綜合實力都有了很大的提升，但同發(fā)達國家相比差距非常明顯。生物技術成果轉化率低，中試能力及產業(yè)化技術水平落后，生物技術成果大多僅限于基礎研究，停留在實驗室研究水平，不能滿足企業(yè)生產和商品化的需要，這都是制約我國生物技術發(fā)展的重要因素。隨著人成纖維生長因子家族的功能多樣化越來越受到更多科研人員甚至生物公司的關注，但在以往的研究中開發(fā)的都普遍停留在實驗室搖瓶階段，大規(guī)模發(fā)酵生產的國內公司很少，建立一套簡單有效的生產工藝，有利于該因子的產業(yè)化進程推進。本實驗篩選得到了50 L規(guī)模中試發(fā)酵生產的最優(yōu)培養(yǎng)基，建立了一種重組人FGF8a的表達生產工藝方案，此外，這種成分簡單、操作容易、成本低廉的發(fā)酵培養(yǎng)基，為后續(xù)的研發(fā)進程奠定了基礎。但后續(xù)對于工業(yè)化生產下游產品純化與活性鑒定還需要其他學者進一步研究與探討。